🔥 心脏组织蛋白提取

蛋白质是生命体中最重要的基本组成部分之一，它们在细胞的结构和功能中起着至关重要的作用。因此，研究蛋白质的结构和功能对于理解生命体的基本机制和开发新药物具有重要意义。蛋白质提取是研究蛋白质的关键步骤之一。

通过物理方式研磨、破碎组织和化学方式增加细胞膜通透性、破坏细胞膜、破坏蛋白相互作用，将细胞中的可溶性蛋白质提取出来。

Western blot、总蛋白水平定量。

试剂：

RIPA、蛋白酶抑制剂 cocktail

SDS-loading buffer、PBS 缓冲液

仪器：

眼科剪、镊子、组织匀浆机、超声破碎仪

低温离心机、BCA 试剂盒、酶标仪

金属浴加热器

1、配置裂解液：一般使用 RIPA 裂解液，裂解强度大，适合 western blot 实验，按每 1 mg 组织需要 10 μL 裂解液来配比，并在裂解液中加入 1% 蛋白酶抑制剂。

蛋白酶抑制剂常选择 cocktail，其抑制效果最全面和稳定，也适用各种蛋白，而普通的 PMSF 不能做磷酸化蛋白。

2、组织的修剪：新鲜心脏组织或解冻心脏组织置于 PBS 中修剪，注意保持冰上操作；取大约 20 mg 的组织，加入 200 μL 裂解液；组织越早加入裂解液越好，因为里面的蛋白酶抑制剂可以有效减缓蛋白的降解。

3、组织的研磨：组织研磨的关键是破碎细胞、细胞器和细胞核，使蛋白充分释放，常用液氮研磨或者组织匀浆的方式，这里主要介绍后者。

用剪子在冰上将组织剪碎至絮状，再组织匀浆机进一步将组织磨碎，最后用超声破碎仪破碎细胞（功率 30 kW，5 秒/5 秒一个循环），5～8 个循环后，液体逐渐澄清，此时即可结束超声，注意研磨的过程会放热，注意保持冰上操作。

4、蛋白的裂解：将组织放在摇床上裂解半小时。

5、蛋白的获取：超声后，在 4 ℃ 离心机 13.3krpm~15krpm 离心 15 分钟，留取上清，此时上清液即为含蛋白的上清。

6、蛋白浓度的测定：常用 BCA 试剂盒测定蛋白质浓度。BCA 检测试剂盒需要先按说明书用标准品做一条标准曲线，要求 R2 在 0.95 以上（0.99 以上更好），随后按试剂盒说明加样，并用酶标仪测定蛋白浓度，将测定的 OD 值带入标准曲线中得到蛋白浓度。

根据经验，心脏组织测定蛋白时需要稀释 12.5 倍左右，此时所得的蛋白的浓度落在标准曲线中部，所得数值更加准确。

要注意的是，测定蛋白浓度时要增加两个复孔，最后取平均值，避免出现加样误差。

7、蛋白的 loading：常规预设蛋白质浓度为 50μg/10 μL（10μL 为 western blot 时每孔上样量），设 BCA 测的蛋白浓度为 c，则每 10 μL 所需蛋白体积 v = 50 μg/c，需要 2 μL undefined SDS-loading buffer，用纯水或 RIPA 补足剩余体积。

加完样本、试剂后，混匀离心，并在 100 ℃ 金属浴中煮 5 分钟后收入 -20 ℃ 冰箱保存。

1）全程冰上操作；

2）修剪好组织尽快加入含蛋白酶抑制剂的裂解液中；

3）组织研磨和超声裂解时注意散热；

4）BCA 测量蛋白浓度和蛋白定量时一定要准确，非常重要，否则可能导致后续实验不准确。对蛋白浓度要求不高可以不做定量；

5）RIPA 裂解液适用于大部分 Western blot 实验，如果做 CO-IP 则考虑用裂解强度低一些的裂解液；

6）组织取材后最好分装，避免反复冻融。

1）蛋白浓度过低：可能由于蛋白降解或者裂解不充分或者加入组织量过少所致，建议全程严格冰上操作，在离心前可以将样品放在摇床上摇半小时及以上等待充分裂解，并且加入组织量不可过少，如果组织只有 10 mg 建议也加入 200 μL 裂解液。另外，心尖部分的蛋白含量相对较低。

2）蛋白定量不齐：严格测定蛋白浓度，根据经验，此步的重要性要大于后续加样不准确。蛋白定量结果用 excel 表格计算标准曲线，R ＞ 0.99 及以上定量相对准确。

3）组间差异大：排除个体差异或者模型可能存在的误差，单从组织提取方面考虑，建议控制取材部位组织块大小和位置，例如，每次都只取左心室。