{分享}多肽小常识
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以下是有关多肽方面的一些资料,同园里的战友共享,希望对做这方面研究的战友有所帮助!!
多肽的基本常识
保存：
大多肽在-20℃很稳定，特别是冷冻干燥并保存在干燥器中，在将它们暴露于空气之前， 冷冻干燥多肽可以放于室温。这将是湿度影响减少，当无法冷冻干燥时，最好的方法是以小的工作样量存放。
对于含Cys, Met orTrP的多肽，脱氧缓冲剂对其溶解必不可少，因为这种多肽可易空气氧化， 在封瓶前，慢慢流过多肽的氮气或氩气也会降低氧化作用。含Gln或Asn的多肽也容易降解，所有这些肽与不含这些有问题解苷的那些肽相比，生命期有限。
溶解性：
大多肽的道选溶剂是超纯抽气水。稀乙酸或氨水分别对于碱性或酸性多肽的溶解很重要。这些方法不溶的多肽， 需要DMF、脲、guanidiniam chloride或acetonitnle来溶解，这些溶剂可能某些实验有副作用。所以我们建议设计多肽时要加注意。
残基Ala, Cys , Ile, Leu, Met, Phe和Val将全增加多肽的溶解难度。
您需要特殊的多肽或任何技术帮助，请随时与我们联系。 我们包你完全满意，对于我们不能适当合成的顺序，我们不收费。
多肽的保存和操做
包装 1mg或更少的多肽按净重包装，声明的小瓶重不含相关抗离子和水。 例如，氨基酸分析决定的肽含量是80%， 在1mg样品中，那么瓶中毛重是1.25mg。
大量的多肽以毛重算。标出的重量含相关抗离子和水， 例如，25mg样品中肽百分比为90%，那么，实际肽量为25mg×90%=22.5mg
不要把肽含量和纯度搞混了。肽的纯度可能是100%， 而肽含量相关带电基团（如Arg, Lys ）的抗离子量和肽新水性决定。这是合成肽的本身特性。
冻干肽的保存
所有产品应存于冰箱， 最好为-20℃。多数肽以此方法可以存放几年不变。
肽溶液的保存
溶液肽远比冻干形式不稳定，溶液应为中性pH(pH5-7), -20℃保存的，为避免样品的反复冻融， 最好分成小样存放。一份样品融冻后未用完， 应扔掉，细菌降解有时会成为溶液肽的麻烦， 为克服此，肽应溶于无菌水， 或肽溶液用0.2μ M滤膜过滤。
多肽的重建和操作
多数肽溶于无菌蒸溜水。初次溶解时，要注意使初始浓度比要求浓度大，如果多肽仅有限溶解性， 这便允许加入其它溶解剂或缓冲盐。
如果多肽在水中的溶解性有限，有几种选择可帮助溶解：
对碱性肽用稀乙酸（含Arg , Lys , His）
酸性肽用稀氨水（含Asp, Glu）
对极疏水的肽用10%有机修饰物（Acetonitnile , Methanol）
极不溶的肽用DM50或DMF
guanicline hydrochloride或脲的浓溶液也很有用， 与上述方法合用， 声处理也是溶解多肽的有效手段。
多肽的包装
目录中所有多肽除特别说明外，纯度为95~98%。包装为小瓶冻干粉。 除特别注明外，多肽净重包装， 例如，1mg瓶的β-amyloid 1-40精确含1mg的多肽。多肽净重由氨基酸分析得到的肽含量计算。例如， 一个多肽样品毛重5mg，氨基酸含量85%， 多肽净重为5mg×0.85=4.25mg。请注意， 多肽含量不是多肽纯度，与抗离子象乙酸盐和溶剂，特别是水结合量合成多肽的本身特性。多肽纯度可能达100%， 但合成品中多肽含量由氨基酸组成，硫水性， 和多肽对溶剂和离子的暴露决定，特别是在纯化过程中， 无论多肽如何纯，冻干粉多肽含量一般为70-85%。 剩余15-30%由其它基本非肽成份构成。
多肽应用和保存
多肽具广泛的溶解性。多肽不溶的主要问题是形成二级结构。除了最太肽外，这点都会发生， 在有多重疏水残基的肽中更显著。盐会促进二级结构形成。我们建议先在无菌蒸馏水或去离子中溶解多肽。如需要增加溶解率， 可用声处理。溶解仍有问题， 加少量稀乙酸（10%）或氨水，会便于溶解。
要长期保存多肽， 最好冷冻干燥，冷干粉可在-20℃或更低存放几年而很少或无降解。溶液中的多肽远不稳定。 多肽易受细菌降解，应用无菌纯化水溶解。
含有Met, Cgs或Try残基的多肽溶液由于氧化，寿命有限。应溶于无氧溶剂， 为防止重复冻融的破坏， 建议溶解过量的肽的便实验，其余多肽以固体形成保存。
固相多肽合成Fmoc方法
任何多肽链的关键连接为肽键，由一个氨基酸的氨基与另氨基酸的缩合形成。通常一个氨基酸由一个中心碳原子组成，它由四个基它基团包围： 氨基、羰基、基和侧链。 侧链，称为R，区别不同氨基酸的结构。某些侧链含有干扰肽键形成的功能团。因此侧链功能团的封闭很重要。
图工显示了Fmoc合成的一般流程，首先第一个Fmoc氨基酸通过一个酸性接头接到不溶载体树脂上，Fmoc去保护通过用碱处理树脂来完成，一般是Poperidine。 用预先激活或原位激活连接第二个Fmoc氨基酸。要求总多肽合成后，通过TFA分离来除去树脂和去保护。
Fmoc分离
固相多肽合成中多肽分离主要用酸解
Fmoc法用弱酸，比如TFA或TMSBr。各种添加剂， 一般为thiol compound , 水和酚，用来保护多肽的免分离中Carbocation的破坏。
下列保护基与TFA和TMSBr分离相合：（略）
基于保护基团的类别，必须使用去保护剂的组合。 例如， 当Boc和tButyl存在时，它们的Carbocation对应物能与Trp, Tyr和Met反应形成tbutyl产物。EDT是极有效的t-butyl trifluoroacetate清除剂， 但它不保护Trp。 因此，必须加水以控制烷基化。Trp的吲哚环和Tyr的OH极易与Pmc反应。水再次表现出对此反应的抑制。Trt和Mtr基团也有相似情形。较此适当组合清除剂将极大降低副反应。
tBoc和CBZ多肽合成
tBoc合成法见图3
tBoc法的分离法
Boc使用强酸，比如HF，TFMSA或TFMoTf。分离加入各种添加剂， 一般为thiol化合物以保护多肽免受carbocation破坏。
HF分离法（如下）略
TFMSOTf分离
TMSOTf分离
SPPS的一般连接方法
适于固相多肽合成的连接反应要求酰化反应，对同源多肽最有效。
Fmoc SPPS连接方法 FmocSPPS最常用的连接法是活性酯， 要么原位，要预先激活。 起初P-nitrophenyl和N-hydnxysuccinimide激活酰是常用形式。 甚至，有HOBt时，连接反应也很慢， 此外，Fmoc氨基酸ONSu、酯与succinimido-carbonyl-β-alanine -N-Hydroxysuccinidide酯副产物的形成相关。今天最常用的激活酯是Opfp和Odhbt。有HoBt时反应速度极快，副产物少。
另一方面， 使用象DCC，HBTU，BOP，BOP-Ce，或TBTU活化剂时， 能原位进行许多连接反应。Carbondiimide的直接添加是最佳选择。 然而，TBTU和HBTU第二个出现，接着BoP, 最后是BoP-CE。再者， 酯连接发现BoP/HoBt>Carbodiimido/HoBt> Carbodiimido/ODHbT> Carbodiimide/Opfp。
最近以来，HOAt和其对应Uronium盐同类物HATU的发展，发现此HoBt和HBTU具更强催化活性， 结果是增加连接产出，缩短连接时间， 消旋降低。 故此，更适合阻位氨基酸的连接，使得难合成肽的合成更成功。
tBoc SPPS的普通连接法
Carbodiimides, 主要是DCC是使用多年的连接试剂，主要的问题是激活和酰化过程中dicyclohexylurea的沉淀。并且伴有许多副反应， 已有几种产生可溶脲的Carbodiimide，例如DIC, t-butylmethyl-和t-tatyllethyl-carbodiimide, 但是这些试剂未解决副反应的问题。结果生产出了新的激活剂。 首先是ＢＯＰ，随后是PyBrop, PyBOP, HBTU, TBTU和ＨＡＴＵ。所有前述试剂都要活性碱基。
所有前面讨论的ＤＣＣ及其衍生物都通过对称酐的形成起作。通常， 对称酐反应性极强已广泛用于ＳＰＳＳ，特别t-Boc合成中， 对称酐整合入Fmoc氨基酸有一些困难，例如，从N-(3-dimethylamino propyl ) -N?/FONT>-ethyl -carbodiimides -HG制备的对称酐， 由于Z-alkory-5(4H)-oxayolne中间体的形成， 在Carbodiimidie和tertiany amines存在时重排， 还有， 不是所有的Fmoc 对称酐都溶于ＤＣＭ，或者无论所有试剂如何都不溶。
对称酐的另一种改变是混合酐，Carboxglic-Carbonate或Ｃarboxglic-phosphinic混合酐， 典型的情况且是， 由活性isobutyl-或isopropyl-choroformate制备这些， 用Nox被阻氨基酸代替phosphinic chloride。通常反应迅速及少或无有副反应。
混合酐，N-carboxy酐(NCAS), 也叫，Leuch酐，已广泛用于多聚氨基酸制备，这类化合物联合Nox保护和活化炭基，一旦和另一个氨基酸或肽残基反应， 释放CO2做为副产物。
用光气处理α氨基酸很容易得到ＮＣＡ衍生物，在严格调控条件下， ＮＣＡ衍生物常结晶析出，便可使用。这些条件要求严格控制合成中的ＰＨ，在ＰＨ值低于１０时，ＮＣＡ和肽或氨基酸残基反应产物，肽-Carbamate易失去CO2形成自由α－氨基端， 发生聚合。pH10.5时，ＮＣＡ便水解隆解。 所以反应在ＰＨ10.2条件下进行。别的条件要求是反应在０℃进行2分钟，要强烈搅动。 反应产物老消旋， 带有自由α-氨基，可以增加另一个酐而延伸。
液相合成
基于将单个N-α保护氨基酸反复加到生长的氨基成份上，合成一步步地进行， 通常从合成链的C端氨基酸开始，接着的单个氨基酸的连接通过用DCC，混合炭酐， 或N-carboxy酐方法实现。Carbodiimide方法包括用DCC做连接剂连接N-和C-保护氨基酸。重要的是， 这种连接试剂促接N保护氨基酸自己炭基和C保护氨基酸自由氨基间的缩水，形成肽链， 同时产出N，N?/FONT>-dyaylcohercylurea副产物。 然而， 此方法因其导致消旋的副反应，或在强碱存在时形成5(4H)-oxaylones和N-acylurea而受到影响。庆幸地是， 这些副反应能最小化，如果还不能完全消除。方法是加入象HoSu或HoBT这样的连接催化剂， 此外，此方法也可用于合成N保护氨基酸的活性酯衍生物。依次产生的活性酯将自发与任何别的C保护氨基酸或肽反应形成新的肽。
当从副产品, diaydohexylurea分离活性酯有困难时，可用混合Carbonic酐方法， 此方法由两步组成，第一步是在有tertiary碱的有机溶剂中用适当的酰基氯激活Nx保护氨基酸的炭基，第二步是让肽或氨基酸的自由氨基与Carbonic酐反应。Carbonic酐通常加到自由氨基的14倍。
虽然此方法在低温时高效高产，产品纯， 但也有其缺点， 例如，由羰基的强激活酐衍生物有消旋倾向。然而此问题在使用Nx-α-Urethane保护基（Cb2, 或tBoc）时便不会发生。进一步： 由于高反应性， 混合Carbonic酐 倾向5(4H)-oxagolomes, Urerbanes diacyimide, 酯的形成， 并易失调。
促进这些副反应的条件是高温，延长激活时间（即，混合酐形成后， 加到alkylchlorocarbonate和amine成份的时间，amine组成的空间占位，平共处和混合酐的不完整形成。幸运的是， 大多这些副反应， 除形成哑唑酮和脲烷外，可通过低温进行反应（~-15℃），大为减少，并且缩短活化时间（~1-2分钟）。为了使哑唑酮和尿烷形成最少，要实行如下措施：1）必要性须用无水有机溶剂，乙酸，四氢 喃，t-butand, 或acetonitrile; 2） 应使用tertiary碱和N-methglmorpholine；3） 必须用C b2或tBoc N- α保护氨基酸。
虽然用isobutyl-和ethylchlorocarbonate常用来形成羰酐， 但确有别的连接试剂，例如，EEQD和IIQD用来与CarboxaP成份反应形成erhyl-或isobutyl carbonate衍生物。 不同于传统酐程序，EEQD和IIQD不要求碱，也不要求低温，通常要求一种有机溶剂（有许多也用）中0.1-0.4M浓度的等摩尔量的羰和氨成份。之后EEQD或IIQD多加5-10%, 温合液室温搅拌15-24小时。真空除去溶剂后，残留物溶于乙酸， 用1NHaHCO3 , 10% 枸橡酸和盐水洗剂，之后用无水Na2So4干燥，蒸发，产品可以重晶结或层析纯化。
这种方法避免了用碱，但仍有消旋和尿烷副产物，水平与经典相当。 所以优势中于容易方便，但应注意，两种方法的详细比较，目前为重仍未有。
HPLC分析和纯化
分析HPLC使用柱子和泵系统，可以经受传递高压，这样可以用极细的微粒（3-10μ m）做填料。由此多肽要在几分钟内高度被分析。
HPLC分两类：离子交换和反相。 离子交换HPLC依靠多肽和固相间的直接电荷相互作用。柱子在一定PH范围带有特定电荷衍变成一种离子体，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸组成表现出相反电荷。 分离是一种电荷相互作用，通过可变PH， 离子强度， 或两者洗脱出多肽，通常， 先用低离子强度的溶液，以后逐渐加强或一步一步加强，直到多肽火柱中洗脱出。离子交换分离的一个例子使用强阳离子交换柱。如sulfoethylaspartimide通过酸性PH中带正电来分离。
反相HPLC条件与正常层析正相反。多肽通过疏水作用连到柱上，用降低离子强度洗脱， 如增加洗脱剂的疏水性。通常柱子由共价吸附到硅上的碳氢烷链构成，这种链长度为G4-G8碳原子。 由于洗脱是一种疏水作用。长链柱比短链对小的， 高带电肽好。另一方面大的疏水肽用短链柱洗脱好。 然而，总体实践中， 这两类柱互变无多少显著差别，别类载体由碳水化合物构成， 比如苯基。
典型的操作常由两绶冲剂组成，0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile 0.1%TFA--H2o稀acetonitrile。用线型梯变以每分钟0.5%到1.0%改变的速度混合。常见分析和纯化用柱为4.6×250mm(3-10μ m)和22×250mm(10μ m). 如果用径向填柱，那么大小是8×100（3-10μ m）和25×250mm(10μ m)
大量各种缓冲剂含许多不同试剂，比如heptafluorobutyric酸，0.1%磷酸， 稀He formic酸(5-6%, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3, 醋酸钠/氨，TFA/TEA，磷酸钠或钾，异戊酚。这样许多不同组合可形成缓冲剂，但要注意一点：硅反相柱料不能长时间暴露于高pH，甚至微碱pH， 因为这样会破坏柱子。
纯化
SPPS提取的粗肽含许多副产物，早期的纯化方法包括离子交换，分溶和反溶注析， 更现代的方法是反相HPLC，一般于60残基或更少的肽很成功。 当反相HPLC失败时，可按合离子交换HPLC。
通常分析HPLC结果用于决定纯化条件。例如，一种太肽用30%（0.1%TFA）acetonitrile洗脱出， 这是分析HPL定出的。那么选择acctonitrile浓度更低的缓冲液使得在isocratic条件下（比如28%,0.1% TFA acetonitrile）多肽在溶剂保持时间4-5分钟后洗脱。这样， 根据柱子类型， 我们的纯化条件用16-35%(0.1%TFA) acetonitrile线型梯度， 在一两小时内完成，之后用分析HPLC查检各种比例，使用我们isocranic条件选定的缓冲液。
多肽的基本常识
保存：
大多肽在-20℃很稳定，特别是冷冻干燥并保存在干燥器中，在将它们暴露于空气之前， 冷冻干燥多肽可以放于室温。这将是湿度影响减少，当无法冷冻干燥时，最好的方法是以小的工作样量存放。
对于含Cys, Met orTrP的多肽，脱氧缓冲剂对其溶解必不可少，因为这种多肽可易空气氧化， 在封瓶前，慢慢流过多肽的氮气或氩气也会降低氧化作用。含Gln或Asn的多肽也容易降解，所有这些肽与不含这些有问题解苷的那些肽相比，生命期有限。
溶解性：
大多肽的道选溶剂是超纯抽气水。稀乙酸或氨水分别对于碱性或酸性多肽的溶解很重要。这些方法不溶的多肽， 需要DMF、脲、guanidiniam chloride或acetonitnle来溶解，这些溶剂可能某些实验有副作用。所以我们建议设计多肽时要加注意。
残基Ala, Cys , Ile, Leu, Met, Phe和Val将全增加多肽的溶解难度。
您需要特殊的多肽或任何技术帮助，请随时与我们联系。 我们包你完全满意，对于我们不能适当合成的顺序，我们不收费。
多肽的保存和操做
包装 1mg或更少的多肽按净重包装，声明的小瓶重不含相关抗离子和水。 例如，氨基酸分析决定的肽含量是80%， 在1mg样品中，那么瓶中毛重是1.25mg。
大量的多肽以毛重算。标出的重量含相关抗离子和水， 例如，25mg样品中肽百分比为90%，那么，实际肽量为25mg×90%=22.5mg
不要把肽含量和纯度搞混了。肽的纯度可能是100%， 而肽含量相关带电基团（如Arg, Lys ）的抗离子量和肽新水性决定。这是合成肽的本身特性。
冻干肽的保存
所有产品应存于冰箱， 最好为-20℃。多数肽以此方法可以存放几年不变。
肽溶液的保存
溶液肽远比冻干形式不稳定，溶液应为中性pH(pH5-7), -20℃保存的，为避免样品的反复冻融， 最好分成小样存放。一份样品融冻后未用完， 应扔掉，细菌降解有时会成为溶液肽的麻烦， 为克服此，肽应溶于无菌水， 或肽溶液用0.2μ M滤膜过滤。
多肽的重建和操作
多数肽溶于无菌蒸溜水。初次溶解时，要注意使初始浓度比要求浓度大，如果多肽仅有限溶解性， 这便允许加入其它溶解剂或缓冲盐。
如果多肽在水中的溶解性有限，有几种选择可帮助溶解：
对碱性肽用稀乙酸（含Arg , Lys , His）
酸性肽用稀氨水（含Asp, Glu）
对极疏水的肽用10%有机修饰物（Acetonitnile , Methanol）
极不溶的肽用DM50或DMF
guanicline hydrochloride或脲的浓溶液也很有用， 与上述方法合用， 声处理也是溶解多肽的有效手段。
多肽的包装
目录中所有多肽除特别说明外，纯度为95~98%。包装为小瓶冻干粉。 除特别注明外，多肽净重包装， 例如，1mg瓶的β-amyloid 1-40精确含1mg的多肽。多肽净重由氨基酸分析得到的肽含量计算。例如， 一个多肽样品毛重5mg，氨基酸含量85%， 多肽净重为5mg×0.85=4.25mg。请注意， 多肽含量不是多肽纯度，与抗离子象乙酸盐和溶剂，特别是水结合量合成多肽的本身特性。多肽纯度可能达100%， 但合成品中多肽含量由氨基酸组成，硫水性， 和多肽对溶剂和离子的暴露决定，特别是在纯化过程中， 无论多肽如何纯，冻干粉多肽含量一般为70-85%。 剩余15-30%由其它基本非肽成份构成。
多肽应用和保存
多肽具广泛的溶解性。多肽不溶的主要问题是形成二级结构。除了最太肽外，这点都会发生， 在有多重疏水残基的肽中更显著。盐会促进二级结构形成。我们建议先在无菌蒸馏水或去离子中溶解多肽。如需要增加溶解率， 可用声处理。溶解仍有问题， 加少量稀乙酸（10%）或氨水，会便于溶解。
要长期保存多肽， 最好冷冻干燥，冷干粉可在-20℃或更低存放几年而很少或无降解。溶液中的多肽远不稳定。 多肽易受细菌降解，应用无菌纯化水溶解。
含有Met, Cgs或Try残基的多肽溶液由于氧化，寿命有限。应溶于无氧溶剂， 为防止重复冻融的破坏， 建议溶解过量的肽的便实验，其余多肽以固体形成保存。
固相多肽合成Fmoc方法
任何多肽链的关键连接为肽键，由一个氨基酸的氨基与另氨基酸的缩合形成。通常一个氨基酸由一个中心碳原子组成，它由四个基它基团包围： 氨基、羰基、基和侧链。 侧链，称为R，区别不同氨基酸的结构。某些侧链含有干扰肽键形成的功能团。因此侧链功能团的封闭很重要。
图工显示了Fmoc合成的一般流程，首先第一个Fmoc氨基酸通过一个酸性接头接到不溶载体树脂上，Fmoc去保护通过用碱处理树脂来完成，一般是Poperidine。 用预先激活或原位激活连接第二个Fmoc氨基酸。要求总多肽合成后，通过TFA分离来除去树脂和去保护。
Fmoc分离
固相多肽合成中多肽分离主要用酸解
Fmoc法用弱酸，比如TFA或TMSBr。各种添加剂， 一般为thiol compound , 水和酚，用来保护多肽的免分离中Carbocation的破坏。
下列保护基与TFA和TMSBr分离相合：（略）
基于保护基团的类别，必须使用去保护剂的组合。 例如， 当Boc和tButyl存在时，它们的Carbocation对应物能与Trp, Tyr和Met反应形成tbutyl产物。EDT是极有效的t-butyl trifluoroacetate清除剂， 但它不保护Trp。 因此，必须加水以控制烷基化。Trp的吲哚环和Tyr的OH极易与Pmc反应。水再次表现出对此反应的抑制。Trt和Mtr基团也有相似情形。较此适当组合清除剂将极大降低副反应。
tBoc和CBZ多肽合成
tBoc合成法见图3
tBoc法的分离法
Boc使用强酸，比如HF，TFMSA或TFMoTf。分离加入各种添加剂， 一般为thiol化合物以保护多肽免受carbocation破坏。
HF分离法（如下）略
TFMSOTf分离
TMSOTf分离
SPPS的一般连接方法
适于固相多肽合成的连接反应要求酰化反应，对同源多肽最有效。
Fmoc SPPS连接方法 FmocSPPS最常用的连接法是活性酯， 要么原位，要预先激活。 起初P-nitrophenyl和N-hydnxysuccinimide激活酰是常用形式。 甚至，有HOBt时，连接反应也很慢， 此外，Fmoc氨基酸ONSu、酯与succinimido-carbonyl-β-alanine -N-Hydroxysuccinidide酯副产物的形成相关。今天最常用的激活酯是Opfp和Odhbt。有HoBt时反应速度极快，副产物少。
另一方面， 使用象DCC，HBTU，BOP，BOP-Ce，或TBTU活化剂时， 能原位进行许多连接反应。Carbondiimide的直接添加是最佳选择。 然而，TBTU和HBTU第二个出现，接着BoP, 最后是BoP-CE。再者， 酯连接发现BoP/HoBt>Carbodiimido/HoBt> Carbodiimido/ODHbT> Carbodiimide/Opfp。
最近以来，HOAt和其对应Uronium盐同类物HATU的发展，发现此HoBt和HBTU具更强催化活性， 结果是增加连接产出，缩短连接时间， 消旋降低。 故此，更适合阻位氨基酸的连接，使得难合成肽的合成更成功。
tBoc SPPS的普通连接法
Carbodiimides, 主要是DCC是使用多年的连接试剂，主要的问题是激活和酰化过程中dicyclohexylurea的沉淀。并且伴有许多副反应， 已有几种产生可溶脲的Carbodiimide，例如DIC, t-butylmethyl-和t-tatyllethyl-carbodiimide, 但是这些试剂未解决副反应的问题。结果生产出了新的激活剂。 首先是ＢＯＰ，随后是PyBrop, PyBOP, HBTU, TBTU和ＨＡＴＵ。所有前述试剂都要活性碱基。
所有前面讨论的ＤＣＣ及其衍生物都通过对称酐的形成起作。通常， 对称酐反应性极强已广泛用于ＳＰＳＳ，特别t-Boc合成中， 对称酐整合入Fmoc氨基酸有一些困难，例如，从N-(3-dimethylamino propyl ) -N?/FONT>-ethyl -carbodiimides -HG制备的对称酐， 由于Z-alkory-5(4H)-oxayolne中间体的形成， 在Carbodiimidie和tertiany amines存在时重排， 还有， 不是所有的Fmoc 对称酐都溶于ＤＣＭ，或者无论所有试剂如何都不溶。
对称酐的另一种改变是混合酐，Carboxglic-Carbonate或Ｃarboxglic-phosphinic混合酐， 典型的情况且是， 由活性isobutyl-或isopropyl-choroformate制备这些， 用Nox被阻氨基酸代替phosphinic chloride。通常反应迅速及少或无有副反应。
混合酐，N-carboxy酐(NCAS), 也叫，Leuch酐，已广泛用于多聚氨基酸制备，这类化合物联合Nox保护和活化炭基，一旦和另一个氨基酸或肽残基反应， 释放CO2做为副产物。
用光气处理α氨基酸很容易得到ＮＣＡ衍生物，在严格调控条件下， ＮＣＡ衍生物常结晶析出，便可使用。这些条件要求严格控制合成中的ＰＨ，在ＰＨ值低于１０时，ＮＣＡ和肽或氨基酸残基反应产物，肽-Carbamate易失去CO2形成自由α－氨基端， 发生聚合。pH10.5时，ＮＣＡ便水解隆解。 所以反应在ＰＨ10.2条件下进行。别的条件要求是反应在０℃进行2分钟，要强烈搅动。 反应产物老消旋， 带有自由α-氨基，可以增加另一个酐而延伸。
液相合成
基于将单个N-α保护氨基酸反复加到生长的氨基成份上，合成一步步地进行， 通常从合成链的C端氨基酸开始，接着的单个氨基酸的连接通过用DCC，混合炭酐， 或N-carboxy酐方法实现。Carbodiimide方法包括用DCC做连接剂连接N-和C-保护氨基酸。重要的是， 这种连接试剂促接N保护氨基酸自己炭基和C保护氨基酸自由氨基间的缩水，形成肽链， 同时产出N，N?/FONT>-dyaylcohercylurea副产物。 然而， 此方法因其导致消旋的副反应，或在强碱存在时形成5(4H)-oxaylones和N-acylurea而受到影响。庆幸地是， 这些副反应能最小化，如果还不能完全消除。方法是加入象HoSu或HoBT这样的连接催化剂， 此外，此方法也可用于合成N保护氨基酸的活性酯衍生物。依次产生的活性酯将自发与任何别的C保护氨基酸或肽反应形成新的肽。
当从副产品, diaydohexylurea分离活性酯有困难时，可用混合Carbonic酐方法， 此方法由两步组成，第一步是在有tertiary碱的有机溶剂中用适当的酰基氯激活Nx保护氨基酸的炭基，第二步是让肽或氨基酸的自由氨基与Carbonic酐反应。Carbonic酐通常加到自由氨基的14倍。
虽然此方法在低温时高效高产，产品纯， 但也有其缺点， 例如，由羰基的强激活酐衍生物有消旋倾向。然而此问题在使用Nx-α-Urethane保护基（Cb2, 或tBoc）时便不会发生。进一步： 由于高反应性， 混合Carbonic酐 倾向5(4H)-oxagolomes, Urerbanes diacyimide, 酯的形成， 并易失调。
促进这些副反应的条件是高温，延长激活时间（即，混合酐形成后， 加到alkylchlorocarbonate和amine成份的时间，amine组成的空间占位，平共处和混合酐的不完整形成。幸运的是， 大多这些副反应， 除形成哑唑酮和脲烷外，可通过低温进行反应（~-15℃），大为减少，并且缩短活化时间（~1-2分钟）。为了使哑唑酮和尿烷形成最少，要实行如下措施：1）必要性须用无水有机溶剂，乙酸，四氢 喃，t-butand, 或acetonitrile; 2） 应使用tertiary碱和N-methglmorpholine；3） 必须用C b2或tBoc N- α保护氨基酸。
虽然用isobutyl-和ethylchlorocarbonate常用来形成羰酐， 但确有别的连接试剂，例如，EEQD和IIQD用来与CarboxaP成份反应形成erhyl-或isobutyl carbonate衍生物。 不同于传统酐程序，EEQD和IIQD不要求碱，也不要求低温，通常要求一种有机溶剂（有许多也用）中0.1-0.4M浓度的等摩尔量的羰和氨成份。之后EEQD或IIQD多加5-10%, 温合液室温搅拌15-24小时。真空除去溶剂后，残留物溶于乙酸， 用1NHaHCO3 , 10% 枸橡酸和盐水洗剂，之后用无水Na2So4干燥，蒸发，产品可以重晶结或层析纯化。
这种方法避免了用碱，但仍有消旋和尿烷副产物，水平与经典相当。 所以优势中于容易方便，但应注意，两种方法的详细比较，目前为重仍未有。
HPLC分析和纯化
分析HPLC使用柱子和泵系统，可以经受传递高压，这样可以用极细的微粒（3-10μ m）做填料。由此多肽要在几分钟内高度被分析。
HPLC分两类：离子交换和反相。 离子交换HPLC依靠多肽和固相间的直接电荷相互作用。柱子在一定PH范围带有特定电荷衍变成一种离子体，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸组成表现出相反电荷。 分离是一种电荷相互作用，通过可变PH， 离子强度， 或两者洗脱出多肽，通常， 先用低离子强度的溶液，以后逐渐加强或一步一步加强，直到多肽火柱中洗脱出。离子交换分离的一个例子使用强阳离子交换柱。如sulfoethylaspartimide通过酸性PH中带正电来分离。
反相HPLC条件与正常层析正相反。多肽通过疏水作用连到柱上，用降低离子强度洗脱， 如增加洗脱剂的疏水性。通常柱子由共价吸附到硅上的碳氢烷链构成，这种链长度为G4-G8碳原子。 由于洗脱是一种疏水作用。长链柱比短链对小的， 高带电肽好。另一方面大的疏水肽用短链柱洗脱好。 然而，总体实践中， 这两类柱互变无多少显著差别，别类载体由碳水化合物构成， 比如苯基。
典型的操作常由两绶冲剂组成，0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile 0.1%TFA--H2o稀acetonitrile。用线型梯变以每分钟0.5%到1.0%改变的速度混合。常见分析和纯化用柱为4.6×250mm(3-10μ m)和22×250mm(10μ m). 如果用径向填柱，那么大小是8×100（3-10μ m）和25×250mm(10μ m)
大量各种缓冲剂含许多不同试剂，比如heptafluorobutyric酸，0.1%磷酸， 稀He formic酸(5-6%, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3, 醋酸钠/氨，TFA/TEA，磷酸钠或钾，异戊酚。这样许多不同组合可形成缓冲剂，但要注意一点：硅反相柱料不能长时间暴露于高pH，甚至微碱pH， 因为这样会破坏柱子。
纯化
SPPS提取的粗肽含许多副产物，早期的纯化方法包括离子交换，分溶和反溶注析， 更现代的方法是反相HPLC，一般于60残基或更少的肽很成功。 当反相HPLC失败时，可按合离子交换HPLC。
通常分析HPLC结果用于决定纯化条件。例如，一种太肽用30%（0.1%TFA）acetonitrile洗脱出， 这是分析HPL定出的。那么选择acctonitrile浓度更低的缓冲液使得在isocratic条件下（比如28%,0.1% TFA acetonitrile）多肽在溶剂保持时间4-5分钟后洗脱。这样， 根据柱子类型， 我们的纯化条件用16-35%(0.1%TFA) acetonitrile线型梯度， 在一两小时内完成，之后用分析HPLC查检各种比例，使用我们isocranic条件选定的缓冲液。
