激光显微切割与蛋白质组学研究
丁香园
2082
1994年澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams首先提出了蛋白质组（Proteome）的概念，它源于蛋白质（Protein）与基因组（Genome）两个词的组合，其定义为在一种细胞内存在的全部蛋白质。蛋白质组学（proteomics）近年来已经迅速发展成为了热门学科。蛋白质组学以基因组编码的所有蛋白为研究对象，从细胞水平及整体水平上研究蛋白质的组成及其变化规律，从而深入认识有机体的各种生理和病理过程。蛋白组学是一个快速发展的新兴学科，它在建立新的诊断方法以及发现人类肿瘤早期的生物标记物方面也具有广阔的前景。
目前，二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）和质谱技术是蛋白质组学研究的核心技术。2D-PAGE的第一向使用固相化pH梯度（immobilized pH gradients, IPG）胶条进行等电聚焦电泳，进行分离，第二向则按照分子量的不同用SDS-PAGE分离，这样就可以把复杂的蛋白混合物在二维平面上分开。这项技术，近年来经过多方面改进，已经成为蛋白质组研究最有使用价值的核心方法。20世纪90年代以后，质谱（mass spectrometry, MS）技术得到了迅速的发展，该技术的基本原理是将样本分子离子化以后，根据离子间质核比（m/z）的差异来分离并确定分子量。目前使用基质辅助激光解吸离子化－飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）技术，可以得到酶解肽段的分子量，获得蛋白质的肽质量指纹图（peptide mass fingerprint, PMF），然后通过相应的数据库搜索来鉴定蛋白质。采用串连质谱（tandem-MS）的方法，可以进行肽的测序，得出肽段的氨基酸序列。此外，近几年迅速发展的一种新的质谱技术――表面增强激光解吸吸附离子化－飞行时间质谱（surface enhanced laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry, SELDI-TOF-MS）技术可以直接在固相的吸附了蛋白质的芯片表面，使用脉冲氮激光能量，使被捕获的靶蛋白从芯片表面电离出来，根据靶蛋白在离子装置中的飞行时间，测量出其分子量。
此外，生物信息学是蛋白质组学研究不可缺少的研究方法。生物信息学涉及蛋白质组信息学，如蛋白质的序列、结构、功能及定位分类、蛋白质连锁图、蛋白质数据库的建立、相关分析软件的开发和应用等方面，还涉及基因与蛋白质的关系，如蛋白质编码基因的识别及算法研究、蛋白质结构、功能预测等。它为2D电泳图像的分析和比较，以及蛋白质的鉴定方面提供了方便快捷的帮助和大量的信息。
然而，无论采用哪种方法，如果在采样初期使用组织块进行蛋白研究的实验结果，往往不尽如人意，通常很难具有很好的重复性。这是由于多数样本是由混合的细胞组成，混合比例不同，不同细胞成分也不同，信号之间又互相有干扰，很难控制样本的一致性。要解决这个问题就要在进行样本分析之前对感兴趣的细胞进行富集，这也一直是疾病研究中遇到的主要困难。研究者尝试了多种获得纯净的感兴趣细胞的方法。依靠抗体进行分离的方法最为常用，但是这需要使用培养的细胞，或是通过酶消化的方法获得细胞悬液作为起始材料，而这并不是原位分离。显微分离系统，能够直接对组织样本进行切割，富集单一类型的细胞。在众多的手动和自动显微切割技术当中，瑞士MMI公司的SL μCUT全自动显微切割系统结合了传统的紫外激光显微切割的高精度，以及膜黏附分离的原位提取的方式，并配合先进的机械和软件的控制，独创了一种全新的激光显微分离的方式。它不但适用于石蜡切片、冰冻切片等多种组织切片的显微分离，还可以进行染色体的显微切割，以及活细胞的显微切割，并且在分离的过程中可以确保样本不受污染，分离下来的活细胞可以继续进行培养。此外，SL μCUT系统具有很好的可升级性，可以满足不断发展的生命科学研究的多种应用。通过SL μCUT系统分离下来的样本，可以保持原有的形态及位置关系，是一种真正的原位分离的方法。
目前，SL μCUT全自动显微切割系统所采用的激光显微切割技术已经成为一种常用的从组织切片中富集感兴趣的细胞的方法，可以排除组织中其他类型细胞的干扰，从而被广泛的应用到DNA和RNA水平的研究中，而在蛋白组学的应用上，尽管应用前景广阔，相对来说还比较新。以下我们简单介绍目前它在蛋白组学研究上的一些应用实例。
胰腺导管癌研究：
胰腺导管癌（PDAC）是所有常见的恶性肿瘤中最为致命的一种，所以迫切需要研究这种疾病早期诊断的标记和治疗的方法。这种疾病通常表现为上皮细胞显著增生，而且在肿瘤块中癌变的细胞相对较少。研究者使用激光显微切割技术富集正常细胞和癌变的胰腺导管上皮细胞。从分离下来的细胞中分别提取蛋白，然后通过二维电泳进行分离。对二维电泳分离得到的蛋白进行银染以进行观察。当然，跑胶时确保使用相同的蛋白上样量非常关键。对比正常的和癌变的胰腺上皮细胞的蛋白图谱，发现其中九个蛋白点表达有差异。其中五个蛋白在肿瘤细胞中上调，而其中四个下调。其中一个在肿瘤细胞中表达增强的蛋白，被确定为钙结合蛋白，S100A6。
为了确定S100A6的过表达对胰腺癌的影响，我们使用了来自46个胰腺癌患者的174个重复点的正常和癌变的胰腺组织样本的组织芯片进行免疫组织化学分析。我们发现，在正常的胰腺导管上皮细胞中缺乏S100A6或是表达量很低。相反，在中等程度或是严重的癌变细胞中，S100A6的表达量非常高。研究结果显示配合使用激光显微切割和二维电泳技术，可以为胰腺导管癌蛋白研究提供一种非常有效的研究方法。
阿尔茨海默症研究：
脑组织中存在淀粉斑是阿尔茨海默症（Alzheimers）的一个病理标记。研究者对从阿尔茨海默症患者的尸体脑部获得的淀粉斑进行了全面的研究。通过激光显微切割系统获得thioflavin-S标记的淀粉斑，其蛋白成分通过液相色谱联合串连质谱（LC-MS/MS）进行分析。研究者在其中发现了488种蛋白，并且发现在neurofilament intermediate chain中多个磷酸化位点，这也表明了在淀粉斑形成过程中涉及的细胞内过程的复杂性和多样性。更值得注意的是，研究者通过从两个阿尔茨海默症患者获得的淀粉斑和淀粉斑周围组织分别进行定量分析，发现了26种在淀粉斑含量很高的蛋白。这几种在淀粉斑中特异表达的蛋白，又通过免疫组织化学实验得到了确认。除了先前确定与淀粉斑相关的重要要素以外，研究者发现了动力蛋白重链与患者尸体中淀粉斑的奇特相关性，并在基因改造的小鼠模型中重复得到了确认，这显示神经元传递可能在神经炎恶化的过程中发挥作用。这个研究结果显示，淀粉斑的亚蛋白结构的研究，对于阿尔茨海默症的生物标记和发病机理的分子机制的研究具有主要的价值。
结合蛋白芯片技术对受污染物质影响的呼吸道进行研究：
研究不同类型的空气污染物质（particulate matter, PM）对健康危害的机理，有利于帮助得出流行病的发病比率和死亡率的生物学上的解释。大多数何种PM对肺造成损伤的信息都是通过生物体外的研究方法得到的。然而，在生物体内的分子机理还不是很清楚。常用的研究PM对肺部损伤的方法很难得到准确的单一位置的、灵敏的而全面的PM导致细胞及分子损伤的病理学机理。在这项研究中，研究者使用激光显微切割技术结合蛋白芯片，研究呼吸道受残余石油飞尘（ROFA）影响的信号通路和转录因子激活。向每只Sprague-Dawley大鼠的气管缓慢地灌输0.5mg的ROFA。用激光显微切割系统获得气管细胞，抽提分离得到细胞的蛋白质，使用蛋白芯片进行分析。暴露在ROFA中的气管细胞的p-ERK:ERK和p-I kappa B:I kappa B的表达增强，这表明细胞的生长有变化，有转化现象，并且伴随气管发炎。这个实验结果与先前体外研究方式得到的结果相吻合，第一次证明了使用激光显微切割和蛋白芯片技术研
究环境中的空气污染对肺部损伤研究的可靠性。
用Western Blot分析激光显微切割获得的少量细胞：
近年来，激光显微切割用于获得特定单一类型的细胞以进行下游的分子研究。由于蛋白在生物体内的含量有限，而且也没有相应的蛋白体外扩增的方法，所以使用激光显微切割进行蛋白组的研究还很依赖于高灵敏度的蛋白检测方法。在这项研究中，研究者建立了一种适于使用少量细胞进行beta-actin和导致细胞调亡的caspase-3蛋白检测的方法。首先，使用培养的U937单核细胞和乙醇固定的人类扁桃体组织的石蜡切片为样本，来优化电泳和Western Blot的条件。使用高性能的NuPAGE BisTris胶配合高质量的转移膜，优化抗体浓度，并且使用高灵敏度的化学发光底物，即使只用500个U937细胞检测beta-actin也可以得到很强的检测信号。用同样的方法，使用1000个细胞可以检测到procaspase-3。用由激光显微切割获得的乙醇固定的石蜡包埋切片中的生发中心细胞可以得到相似的结果。使用etoposide处理U937细胞诱导细胞调亡时，可用2500个细胞（约0.8pg蛋白）检测到caspase-3。实验结果显示Western Blot是一种合适的对激光显微切割获得的样本进行蛋白组分析的方法。
正常和病变的组织中都包含有复杂的不同类型的细胞，包含的细胞又有不同的发展阶段，众多细胞混杂在一起。如果希望研究核酸的变化、蛋白的表达，以及引发疾病的机理，就需要确定并分离单一类型的细胞。激光显微切割技术是目前越来越被广泛采用的一种分离技术。而蛋白质组学是基因表达研究的一种补充，它可以提供更多的转录后修饰和转录后调控的信息。研究技术上的进步，尤其是二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）和质谱技术的发展，使得基于蛋白质组学研究的蛋白水平的基因表达研究得到了很大的发展。同2D-PAGE和激光解吸/粒子质谱一样，通过Western Blot和蛋白芯片技术，也可以提供对感兴趣的样本的蛋白研究的特异性。研究技术上的不断进行，必将推动蛋白组学的发展，而激光显微切割技术，也将是未来蛋白组学研究的支柱技术之一。
目前，二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）和质谱技术是蛋白质组学研究的核心技术。2D-PAGE的第一向使用固相化pH梯度（immobilized pH gradients, IPG）胶条进行等电聚焦电泳，进行分离，第二向则按照分子量的不同用SDS-PAGE分离，这样就可以把复杂的蛋白混合物在二维平面上分开。这项技术，近年来经过多方面改进，已经成为蛋白质组研究最有使用价值的核心方法。20世纪90年代以后，质谱（mass spectrometry, MS）技术得到了迅速的发展，该技术的基本原理是将样本分子离子化以后，根据离子间质核比（m/z）的差异来分离并确定分子量。目前使用基质辅助激光解吸离子化－飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）技术，可以得到酶解肽段的分子量，获得蛋白质的肽质量指纹图（peptide mass fingerprint, PMF），然后通过相应的数据库搜索来鉴定蛋白质。采用串连质谱（tandem-MS）的方法，可以进行肽的测序，得出肽段的氨基酸序列。此外，近几年迅速发展的一种新的质谱技术――表面增强激光解吸吸附离子化－飞行时间质谱（surface enhanced laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry, SELDI-TOF-MS）技术可以直接在固相的吸附了蛋白质的芯片表面，使用脉冲氮激光能量，使被捕获的靶蛋白从芯片表面电离出来，根据靶蛋白在离子装置中的飞行时间，测量出其分子量。
此外，生物信息学是蛋白质组学研究不可缺少的研究方法。生物信息学涉及蛋白质组信息学，如蛋白质的序列、结构、功能及定位分类、蛋白质连锁图、蛋白质数据库的建立、相关分析软件的开发和应用等方面，还涉及基因与蛋白质的关系，如蛋白质编码基因的识别及算法研究、蛋白质结构、功能预测等。它为2D电泳图像的分析和比较，以及蛋白质的鉴定方面提供了方便快捷的帮助和大量的信息。
然而，无论采用哪种方法，如果在采样初期使用组织块进行蛋白研究的实验结果，往往不尽如人意，通常很难具有很好的重复性。这是由于多数样本是由混合的细胞组成，混合比例不同，不同细胞成分也不同，信号之间又互相有干扰，很难控制样本的一致性。要解决这个问题就要在进行样本分析之前对感兴趣的细胞进行富集，这也一直是疾病研究中遇到的主要困难。研究者尝试了多种获得纯净的感兴趣细胞的方法。依靠抗体进行分离的方法最为常用，但是这需要使用培养的细胞，或是通过酶消化的方法获得细胞悬液作为起始材料，而这并不是原位分离。显微分离系统，能够直接对组织样本进行切割，富集单一类型的细胞。在众多的手动和自动显微切割技术当中，瑞士MMI公司的SL μCUT全自动显微切割系统结合了传统的紫外激光显微切割的高精度，以及膜黏附分离的原位提取的方式，并配合先进的机械和软件的控制，独创了一种全新的激光显微分离的方式。它不但适用于石蜡切片、冰冻切片等多种组织切片的显微分离，还可以进行染色体的显微切割，以及活细胞的显微切割，并且在分离的过程中可以确保样本不受污染，分离下来的活细胞可以继续进行培养。此外，SL μCUT系统具有很好的可升级性，可以满足不断发展的生命科学研究的多种应用。通过SL μCUT系统分离下来的样本，可以保持原有的形态及位置关系，是一种真正的原位分离的方法。
目前，SL μCUT全自动显微切割系统所采用的激光显微切割技术已经成为一种常用的从组织切片中富集感兴趣的细胞的方法，可以排除组织中其他类型细胞的干扰，从而被广泛的应用到DNA和RNA水平的研究中，而在蛋白组学的应用上，尽管应用前景广阔，相对来说还比较新。以下我们简单介绍目前它在蛋白组学研究上的一些应用实例。
胰腺导管癌研究：
胰腺导管癌（PDAC）是所有常见的恶性肿瘤中最为致命的一种，所以迫切需要研究这种疾病早期诊断的标记和治疗的方法。这种疾病通常表现为上皮细胞显著增生，而且在肿瘤块中癌变的细胞相对较少。研究者使用激光显微切割技术富集正常细胞和癌变的胰腺导管上皮细胞。从分离下来的细胞中分别提取蛋白，然后通过二维电泳进行分离。对二维电泳分离得到的蛋白进行银染以进行观察。当然，跑胶时确保使用相同的蛋白上样量非常关键。对比正常的和癌变的胰腺上皮细胞的蛋白图谱，发现其中九个蛋白点表达有差异。其中五个蛋白在肿瘤细胞中上调，而其中四个下调。其中一个在肿瘤细胞中表达增强的蛋白，被确定为钙结合蛋白，S100A6。
为了确定S100A6的过表达对胰腺癌的影响，我们使用了来自46个胰腺癌患者的174个重复点的正常和癌变的胰腺组织样本的组织芯片进行免疫组织化学分析。我们发现，在正常的胰腺导管上皮细胞中缺乏S100A6或是表达量很低。相反，在中等程度或是严重的癌变细胞中，S100A6的表达量非常高。研究结果显示配合使用激光显微切割和二维电泳技术，可以为胰腺导管癌蛋白研究提供一种非常有效的研究方法。
阿尔茨海默症研究：
脑组织中存在淀粉斑是阿尔茨海默症（Alzheimers）的一个病理标记。研究者对从阿尔茨海默症患者的尸体脑部获得的淀粉斑进行了全面的研究。通过激光显微切割系统获得thioflavin-S标记的淀粉斑，其蛋白成分通过液相色谱联合串连质谱（LC-MS/MS）进行分析。研究者在其中发现了488种蛋白，并且发现在neurofilament intermediate chain中多个磷酸化位点，这也表明了在淀粉斑形成过程中涉及的细胞内过程的复杂性和多样性。更值得注意的是，研究者通过从两个阿尔茨海默症患者获得的淀粉斑和淀粉斑周围组织分别进行定量分析，发现了26种在淀粉斑含量很高的蛋白。这几种在淀粉斑中特异表达的蛋白，又通过免疫组织化学实验得到了确认。除了先前确定与淀粉斑相关的重要要素以外，研究者发现了动力蛋白重链与患者尸体中淀粉斑的奇特相关性，并在基因改造的小鼠模型中重复得到了确认，这显示神经元传递可能在神经炎恶化的过程中发挥作用。这个研究结果显示，淀粉斑的亚蛋白结构的研究，对于阿尔茨海默症的生物标记和发病机理的分子机制的研究具有主要的价值。
结合蛋白芯片技术对受污染物质影响的呼吸道进行研究：
研究不同类型的空气污染物质（particulate matter, PM）对健康危害的机理，有利于帮助得出流行病的发病比率和死亡率的生物学上的解释。大多数何种PM对肺造成损伤的信息都是通过生物体外的研究方法得到的。然而，在生物体内的分子机理还不是很清楚。常用的研究PM对肺部损伤的方法很难得到准确的单一位置的、灵敏的而全面的PM导致细胞及分子损伤的病理学机理。在这项研究中，研究者使用激光显微切割技术结合蛋白芯片，研究呼吸道受残余石油飞尘（ROFA）影响的信号通路和转录因子激活。向每只Sprague-Dawley大鼠的气管缓慢地灌输0.5mg的ROFA。用激光显微切割系统获得气管细胞，抽提分离得到细胞的蛋白质，使用蛋白芯片进行分析。暴露在ROFA中的气管细胞的p-ERK:ERK和p-I kappa B:I kappa B的表达增强，这表明细胞的生长有变化，有转化现象，并且伴随气管发炎。这个实验结果与先前体外研究方式得到的结果相吻合，第一次证明了使用激光显微切割和蛋白芯片技术研
究环境中的空气污染对肺部损伤研究的可靠性。
用Western Blot分析激光显微切割获得的少量细胞：
近年来，激光显微切割用于获得特定单一类型的细胞以进行下游的分子研究。由于蛋白在生物体内的含量有限，而且也没有相应的蛋白体外扩增的方法，所以使用激光显微切割进行蛋白组的研究还很依赖于高灵敏度的蛋白检测方法。在这项研究中，研究者建立了一种适于使用少量细胞进行beta-actin和导致细胞调亡的caspase-3蛋白检测的方法。首先，使用培养的U937单核细胞和乙醇固定的人类扁桃体组织的石蜡切片为样本，来优化电泳和Western Blot的条件。使用高性能的NuPAGE BisTris胶配合高质量的转移膜，优化抗体浓度，并且使用高灵敏度的化学发光底物，即使只用500个U937细胞检测beta-actin也可以得到很强的检测信号。用同样的方法，使用1000个细胞可以检测到procaspase-3。用由激光显微切割获得的乙醇固定的石蜡包埋切片中的生发中心细胞可以得到相似的结果。使用etoposide处理U937细胞诱导细胞调亡时，可用2500个细胞（约0.8pg蛋白）检测到caspase-3。实验结果显示Western Blot是一种合适的对激光显微切割获得的样本进行蛋白组分析的方法。
正常和病变的组织中都包含有复杂的不同类型的细胞，包含的细胞又有不同的发展阶段，众多细胞混杂在一起。如果希望研究核酸的变化、蛋白的表达，以及引发疾病的机理，就需要确定并分离单一类型的细胞。激光显微切割技术是目前越来越被广泛采用的一种分离技术。而蛋白质组学是基因表达研究的一种补充，它可以提供更多的转录后修饰和转录后调控的信息。研究技术上的进步，尤其是二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）和质谱技术的发展，使得基于蛋白质组学研究的蛋白水平的基因表达研究得到了很大的发展。同2D-PAGE和激光解吸/粒子质谱一样，通过Western Blot和蛋白芯片技术，也可以提供对感兴趣的样本的蛋白研究的特异性。研究技术上的不断进行，必将推动蛋白组学的发展，而激光显微切割技术，也将是未来蛋白组学研究的支柱技术之一。
