【原创】质粒DNA生产工艺的研究
丁香园
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随着核酸疫苗和基因治疗的迅速发展，高纯度的，符合药物动力学的质粒DNA的需求越来越大，本人准备的论文综述初稿，对目前大规模进行质粒DNA生产的流程有一些初步见解，与大家一起探讨。
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综述： 质粒DNA生产工艺的研究进展
一、质粒DNA
细菌质粒（plasmid）是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的
遗传成分，除了酵母的杀伤质粒（killer plasmid）是一种RNA质粒之外，迄今所知的所有质粒无一例外地都是属于这种类型的DNA分子[1]，质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代[2]，为了更好地适应细胞的生理特点，质粒主要以细长并具有负超螺旋结构的形式存在于原核细胞中[3]。环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：超螺旋型（SC）质粒DNA；开环型（OC）质粒DNA和线性（L）质粒DNA分子[4]。
用于基因工程改造的质粒载体通常包括复制子、选择标记和目的基因和启动子[5]，为了获得高稳定性、高产量的质粒DNA，在构建质粒DNA时，需仔细从以下几个方面着手考虑。
1. 质粒复制子的选择
Prazeres[6]报道到2010年，以质粒为核心的基因免疫和治疗的市场产值将会超过450亿美元，质粒DNA的需求不断加大。因此，无论从科学还是经济角度出发，在构建DNA疫苗和基因治疗用途的质粒时，为了提高质粒产量，复制子的选择非常关键，目前，绝大多数学者选择拷贝数高且仅需宿主编码蛋白的ColE1复制子[7]。在携带ColE1复制子的质粒中，RNAII是复制的正向调节分子，RNAI是复制的负调节物，另外，由质粒编码的一种Rop/Rom蛋白可提高RNAI与RNAII结合的效率，增强RNAI的负调控作用，因此，Rop/Rom基因缺失至少可使colE1质粒拷贝数提高3至4倍[8]。Yavachev 和 Wang [9-10]研究报道非荷载的转移RNA的二氢尿嘧啶环、反义环和CCA序列可与RNA I或RNAII的环有高度的同源性，从而会影响到质粒DNA的复制，但是其具体机制还有待进一步的研究。
据Minton[11]报道，pUC19系列载体同样被缺失了rop基因，但其与其他缺失rop基因的质粒在拷贝数上的表现却不尽相同，这是由于pUC质粒在RNAII序列上带有一个G到A的点突变，可依温度的不同而改变正向调节分子RNAII的二级结构，Chambers S &Yanisch-Perron C等研究表明在42℃或者45℃下，RNAII似乎折叠成抗RNAI抑制的构型，于是DNA合成的起始加强，结果拷贝数特别高[12-14]。
尽管构建DNA疫苗时普遍使用ColE1类型复制子，但Uhlin B & Remaut E报道的一种由低拷贝发展而来的由温度控制的“失控型”复制子同样具有巨大的应用前景，这种失控的质粒可使质粒DNA大量积聚在大肠杆菌中，其拷贝数可以高达1000[15-16]，Ansorge M和Chao Y证实这种拷贝数已成功地应用来表达大量的重组蛋白[17-18]，尽管“失控型”复制子的优势非常明显，但还没有使用这个类型复制子来构建DNA疫苗的成功例子，至今不清楚什么是导致此种复制子未得到开发的具体原因[19]。
2. 抗性基因的选择
在选择抗生素抗性基因时，由于极少量即可引起部分人群强烈的过敏反应，首先应避免β-内酰胺类抗生素的使用，而应考虑氨基糖苷类的新霉素和卡那霉素[20]，因为这些氨基糖苷类的抗生素在临床上很少使用，且无耳毒性、肾毒性等副作用，所以更为合适[19]。
3. 其他元件的考虑
设计、构建DNA疫苗和基因治疗质粒载体的策略已经十分明显，它除了必须包括一个能使质粒在大肠杆菌中维持、分裂的元件；一个能促使目的基因在机体内表达的元件和选择标记外，还包括其他一些调控元件，以促使转基因的表达和质粒的稳定[21]，这些元件包括真核启动子、终止子及其终止信号等，启动子是外源基因在动物细胞内获得表达的必要前提，常见的有CMVI/E、SV40、EF-1α及UbC和MHCI等，CMV比SV40[22]和UbC[23]等更为有效，其中内含子A更能提高CMVI/E的表达水平[22]，CMV现已被广泛使用在商品化载体上，这对商业开发DNA疫苗来说是十分有帮助的。另外，一些抗原基因本身来源的启动子也可用来构建DNA疫苗，但对于想同时表达多个抗原基因的质粒而言，此种启动子的效果不明显；常用的转录终止子及终止信号包括牛生长激素（BGH）、SV40及人β-珠蛋白。此外，在构建DNA疫苗时，可利用非甲基化的细菌DNA-CpG寡脱氧核苷酸来优化整个质粒，提高DNA疫苗的免疫原性，这是因为真核生物CpG的概率只有原核生物的1/16左右[24]，这种频率上的差异使得其与模式识别受体TLR-9的相互作用，提高了免疫应答水平[25]。
4. 目的基因
在选择和构建质粒DNA时，首先应考虑的是质粒DNA可否整合入宿主基因组，因此，在选择目的基因时，须严格避免目的基因同人类基因组之间具有长片断的同源序列；启动子和终止子同样须认真筛选以严格控制其生物学活性；此外所有构建质粒DNA的过程需要有详细的记录，且附有基因的序列，宿主菌的表型和基因型鉴定[26-32]。
5. 质粒的稳定性
质粒DNA导入宿主细胞后，必将引起宿主菌生理发生改变[33]，质粒的复制增加了宿主菌的负担，引起宿主菌生长速率下降，使得重组工程菌的发酵过程比非重组菌的发酵过程复杂化，进而有可能降低质粒DNA的稳定性；同时，外源基因的插入也会干扰到质粒本身的稳定性，在以大肠杆菌为宿主的发酵过程，还必须考虑到宿主菌的遗传特性[34-36]，判定其是否存在可以降解重组DNA，或者产生引起重组DNA的不稳定性的蛋白酶或其他一些蛋白分子。
5.1 质粒不稳定性的概念
质粒不稳定性，是指工程菌在生长过程中重组质粒发生变化，结果不呈现原有的表型特征。质粒不稳定可分为两类：分离不稳定性和结构不稳定性[37]。分离不稳定是指在细胞分裂中由于缺陷分配引起部分或全部质粒的丢失；结构不稳定则是由于重组质粒DNA上的缺失、插入或重排引起的，质粒的分配不稳定性和结构不稳定性的结果都将使我们得不到预期的质粒产量和质量。如果发生质粒分离不稳定，由于部分重组质粒的丢失，工程菌的发酵过程实际上是工程菌和不含有质粒的宿主菌的混合培养，Imanaka[38]证实在非选择性条件下，含有重组质粒的工程菌的比生长速率（μ+）往往小于宿主细胞的比生长速率(μ-)，经过25代后，培养液中几乎都是无质粒的细胞。
5.2 质粒拷贝数
质粒拷贝数是体现质粒稳定性的一个重要特征，拷贝数首先决定于自身的遗传特性，同时也受到宿主菌生理状况及生长环境的影响，Enberg & Nordstorm[39]研究认为宿主菌生长速率增大，质粒的拷贝数下降，这可能是高比生长速率下，质粒的复制速度跟不上细胞分裂的速度，从而质粒拷贝数不断下降。此外，Koizumi[40]的研究同样证实了营养物质的限制或缺乏也会导致质粒拷贝数的下降。一般来讲，质粒拷贝数对质粒稳定性的影响因质粒的不同而不同，Futcher & Cox[41]对几种质粒的稳定性进行了研究，发现质粒稳定性随着拷贝数的增大而增加，但当质粒拷贝数太高时，质粒也往往不稳定，因多次复制，增加了出差错的机会。
5.3 培养方式对质粒稳定性的影响
培养基对质粒的稳定性也起着非常重要的作用，Caulcott [42]研究表明质粒在以葡萄糖作为碳源时的丢失频率大于以淀粉为碳源的培养基。低温往往有利于重组质粒稳定地遗传，而当温度高于50℃时，重组质粒在分批培养的对数后期和连续培养时均呈现遗传不稳定状态[43]。
5.4 解决办法
在重组基因工程菌发酵过程中，克服质粒丢失的最广泛使用也是最有效的方法就是添加针对抗性基因的抗生素。FDA规定不管在生产还是管理上都应用卡那霉素代替氨苄青霉素，其原因是考虑到β内酰胺类抗生素是一种强烈的过敏原；另外，用抗生素添加法来消除质粒脱落性的不稳定性在大规模生产时并不可取，因为这种选择压力只能维持一段时间，要从根本上解决这个问题，需要研究影响质粒稳定性的各个过程（质粒的复制、质粒的转移及质粒在子代细胞中的分配等）[44]；此外，质粒的平衡致死系统有可能为彻底摒弃抗生素的使用奠定基础[45]。
二、菌种库的建立
对转化大肠杆菌的条件进行优化。建立原始种子库。分析种子库的遗传稳定性，要明确该种子库可以传代的次数。在此基础上建立主细胞库和工作细胞库，并应保证该类细胞库没有噬菌体和其它外源因子的污染；并对细菌的遗传背景进行分析和检测，保证细胞库中细菌的遗传背景包括基因型、表型未发生改变；应检测细菌的形态学，保证细菌的均一性；应检测导入基因的存在状态。并对工作细胞库的规模、保存条件、扩增条件、传代过程中质粒的稳定性（拷贝数及表达量）、允许的传代次数等进行研究。
三、含重组质粒基因工程菌的发酵
影响质粒 DNA 产量的因素最重要的是宿主菌株的遗传背景和质粒分子本身的拷贝数，除此之外，在工业发酵中宿主菌株的生长条件和培养基类型也是不可忽视的条件。一般建议使用 endA 基因发生突变的（endA1）大肠杆菌宿主菌株，例如 DH5α，JM109，以及 XL1-Blue 等，因为 endA 基因突变的结果，使得大肠杆菌宿主细胞失去了合成具有功能活性的核酸内切酶Ⅰ的能力，从而增进了所含质粒 DNA 分子的稳定性[46]。
在典型的分子生物学实验中，质粒是由大肠杆菌在摇瓶中发酵生产的，温度、转速和培养基是唯一可控制的因素[47]。一般培养物的质粒产量在 1-10mg 之间；在高密度培养的发酵罐中，诸如培养基组成、温度、pH 值、溶解氧、积累的代谢产物，搅拌速度等影响细菌及质粒产量的因素都能得到监测和控制，质粒产量可达摇瓶的10到50倍[48]，Lahijani R[49]的研究数据显示每升培养基可以产出220mg质粒DNA，Schmidt T[50]也表明质粒产量可达225mg/L。高密度培养技术的出现，不仅能增加产率，而且也为减少发酵罐容积、减轻分离纯化、减少污水、降低能耗和成本带来好处。
3.1 培养基的组成
大肠杆菌可以在营养丰富或贫乏的培养基中生长，但是营养物的种类及来源对质粒DNA的质量和数量都产生重大影响[51]。由于可生产高的细胞密度，丰富的、复合培养物，如酵母膏和/或蛋白水解物很受欢迎，肉膏因为可能含有疯牛病等动物病毒而成为潜在的污染源被排除在外。除了丰富营养物，还需加入葡萄糖或甘油等碳源物质，Korz[52]研究表明，以甘油为基础的碳源培养基的生长速度较慢，几乎不产生乙酸，终产物也比以葡萄糖为碳源的培养基多，但当它们超过一定的范围时都会阻止细胞的生长，这就解释了为什么在间歇发酵中增加营养物的浓度并不能得到高细胞密度的原因。
目前，常用的有三种形式的培养基：限制性培养基、半限制性培养基和复合培养基，其可重复性依次降低。O’Kennedy[53]的研究结果表明，半限制性培养基生产质粒pSV的产量为9.12μg/mg干菌，比复合培养基的4-6μg/mg干菌高一些。同时， O’Kennedy[54]还证实了用于质粒生产培养基最佳的C︰N为2.78︰1，最大比例不要超过12︰1，因为在此范围内，细菌膜上的肽聚糖的成分没有发生改变，不会影响到化学裂解的特性，在试验过程中，O’Kennedy还发现添加氨基酸后的限制性培养基SDCAS，无论在提高质粒超螺旋的比例上还是在减少质粒的丢失率上都比LB培养基的效果好，且SDCAS经碱裂解后产生的宿主基因组DNA也明显减少。
3.2 发酵方式的选择
发酵一般以分批或者流加的方式进行[55]。在这两种方式中，流加发酵可以提高细胞密度，并因此可能改变质粒的质量，Matsui[56]报道在发酵过程中添加固体葡萄糖，可以使DCW(dry cell weight)达到134g/L，质粒在细胞中一般呈现负超螺旋结构，但据了解，宿主菌的生长条件，溶解氧及温度等的改变都可以改变超螺旋质粒的密度[57]。D.J.Korz[58]研究证实，溶氧不足或CO2过剩都会促进乙酸形成，促使细胞衰老和死亡，降低质粒DNA的产量和质量。
Lahijani[59] 探讨了温度和流加操作对质粒产量的影响，培养物在连续流加操作中保持 37℃直至 OD600达到某个数值后，升温至 42℃或 45℃，这样可大大提高质粒的产量，补料过程中，可尽量使用氨水来调节pH，这样可以补充氮源。也有实验指出质粒的生产因为质粒本身而异，相同发酵条件下不同的质粒产量会有很大差异；但多数研究者认为，控制细菌较低的比生长速率，对质粒的复制有很大的好处，因为，宿主菌过快的直接后果是质粒复制跟不上细菌的生长，导致拷贝数下降或者质粒丢失。理想的质粒收获阶段应该是在细菌生长进入生长对数后期或静止期前期，此时RNA转录，蛋白质翻译的水平处于最低，质粒的复制达到最高水平。
1989年，Reinikainen [60]研究小组得出结论，pH值介于6.2-6.8之间和30℃的培养温度有利于ColE1类型复制子质粒产量的提高，此外，添加氯霉素[61]，氨基酸饥饿[62]，添加痕量维生素[63]等都可以提高质粒DNA的产量。
四、质粒的分离和纯化
在质粒的最终产物中，宿主基因组片段、高分子量的RNA尤其是核糖体RNA和质粒的异构体不利于质粒的基因转染，因此，如何有效消除这些杂质尤为关键。因为质粒DNA的这种带负电荷的多形结构使得它的电荷性和亲水性能够与许多分子如内毒素和杂蛋白相结合，加大了其纯化的难度，虽然目前有很多种方法可用来纯化质粒DNA，但迄今并没有一个相关的标准。
在实验室未优化的条件下，质粒产量通常较低，且提取和制备的质粒DNA损失严重，不符合FDA等相关组织机构的条例。除此之外，质粒的大规模提取要考虑到如何降低生产成本，并按照生物制品评价和研究中心（Center for Biologics Evaluation and Rrsearch, CBER）下属的疫苗研究和管理办公室已有的章程严格执行 [64]。
如前所述，质粒纯化时，主要考虑四种杂质：gDNA，RNA，蛋白质和内毒素。质粒的工业化大规模生产除了要除去这些杂质之外，还应该避免使用有毒，有机、易燃试剂和动物源性的酶试剂[65]。在保证产率和纯度合格的情况下应选择省时、省成本、省纯化工艺的操作流程。所有的操作都应该能够放大到每批生产克级甚至千克级的质粒。最重要的是，所有过程要有重复性，这样才能使生产出的质粒一直符合产品规格。一般的，质粒的大规模纯化包括下面几个或所有步骤：细胞裂解，沉淀，酶消化，柱层析（一步或多步），脱盐或着改变缓冲液，以及无菌过滤。质粒的大规模生产纯化的大致流程如下图所示[66]：
4.1 细胞收集
细胞培养结束后，必须通过连续流或者微过滤[67]对培养菌体进行浓缩，这不仅仅是要对菌体进行浓缩，而且是为了去除对接下来的纯化有影响的培养基成分。
4.2 细胞裂解
细菌细胞裂解是纯化流程中的关键一步。可以通过多种手段来完成细胞的破
碎：机械破碎（珠磨法、渗透压冲击等），酶解法，热裂解和碱裂解法。
4.2.1 机械裂解
关于机械破碎裂解大肠杆菌以释放质粒的研究表明只有微流体化和珠磨法能获得完整的质粒分子。当用微流化器破碎细胞达65％时，质粒最多可以回收35％，而用玻璃珠研磨破碎细胞达50％时质粒分子最多可以回收达74％，用微流化和玻璃珠研磨破碎细胞后，超螺旋质粒在总释放质粒中分别为80％和94％，增加细胞破碎频率将使超螺旋质粒减少至10％以下[68]，绝大多数质粒呈现“smear”形状，为获得相对产量较高的超螺旋质粒必须降低细胞破碎率，因此，在规模化生产上，这些破碎方法并不适用。
4.2.2 热裂解
Zhijun Wang[69]等研究认为热裂解具有不需完全破裂细胞、价格低廉、操作简便快捷等诸多优点，其所需设备一般有蠕动泵、去污剂和循环热水浴等，但是我们的热裂解实验结果表明：靠蠕动泵将悬浮在Triton、EDTA中的菌液循环于沸水浴一段时间后，得到的菌液粘度太大，不易下一步操作，且含有的宿主基因组DNA太多，因此我们放弃了进一步的尝试。
4.2.3 碱裂解
目前最受欢迎的细胞裂解法是由 Birnboim & Doly[70]提出的碱裂解法，它主要是靠0.2M NaOH、 1%SDS和pH4.8的KAC来完成的，它的整个步骤包括我们常说的SolutionI、SolutionII、SolutionIII三步，首先是将菌体悬浮在SolutionI中，其中的EDTA比较关键，它起着两个作用：（1）鰲合细胞膜和骨架上的Ca2+、Mg2+，从而使细胞更易破碎（2）鰲合Mg2+，使得内源性DNase没有Mg2+不能发挥作用，保持质粒DNA的稳定性，另外SolutionI中的Tris起着稳定pH的作用，葡萄糖起着缓冲防止gDNA断裂的作用。SolutionII是非常关键的一步，SDS破坏胞膜，释放菌体内容物，同时也能使绝大多数的蛋白质和脂肪变性并溶解，NaOH使质粒DNA和基因组DNA都变性，而质粒DNA由于有特有的拓扑超螺旋结构，可以在下一步中自然复性，而基因组DNA则永久变性，在这一步中注意事项是在混匀过程中动作必须轻柔，原因是防止局部pH大于13而导致质粒DNA不可逆变性和粗暴操作导致的基因组断裂，局部高浓度的SDS也会形成鬼带（ghoast band）[71]。接下来的是用SolutionIII进行中和，使质粒DNA复性，同时高浓度的KAC也起到了盐析的作用，最终形成的SDS-gDNA-蛋白不可溶复合物而被去除，这一步使得变性的蛋白质和脂质变成不溶的，凝乳状的沉淀，同时一部分染色体 DNA也沉淀出来，而质粒 DNA 仍然呈溶解状态。这是因为染色体 DNA 和一些蛋白质及脂质是部分相连的，而质粒通常没有这种连接状态。在最终的沉淀步骤，考虑到质粒DNA双螺旋结构是由两条带磷酸基的骨架构成，存在着互相排斥的可能性，所有可以在其中加入一些NaCl和NaAC等使得DNA更易沉淀，天气炎热时还可降低温度，以抵消布朗运动效应带来的质粒不易沉淀的后果。
由于SolutionIII中KAC的成本非常昂贵，为了降低生产成本，我们根据溶液III的原理，摸索了许多种新配方，同样也能达到相似的效果，成本却大大降低，为大规模生产质粒DNA提供了有力的保证。
4.2.4 苯酚、氯仿直接抽提法
1999年，Jun Song[72]等人报道了用苯酚和氯仿直接抽提培养菌液来获得质粒DNA的技术，这项技术可以大大节约质粒提取的时间，尤其体现在通量筛选重组克隆时优势明显，但其不能去除宿主基因组DNA。
4.3 质粒制备液的净化和浓缩
在实验室水平上，去除细胞碎片、变性蛋白和核酸沉淀物的办法通常是离心。然而，这并不适用于质粒DNA 的工业化生产。在工业操作中，这应该由被证明是产生剪切力低的操作来完成。这是因为：第一，应避免将染色体 DNA 剪切成片段，否则染色体 DNA 将从沉淀中释放并污染质粒；第二，质粒在分离过程中也要受到剪切，如果质粒分子较大，则可能发生分子链的断裂。工业上的离心机通常采用连续流加方式操作以达到高的处理量。进入离心机的流体所产生的离心加速度可能导致剪切，从而打散已经沉淀的物质和 gDNA。因此，过滤成为比较理想的操作，但是如何防止粘稠的沉淀复合物不堵住过滤孔还是一个复杂的技术难题。
质粒 DNA在大肠杆菌裂解液中只占总核酸的 1%(w/w)[73]，裂解后，仍然存在大量的 RNA 和蛋白质，这些都必须在随后的步骤中被去除，同时应该降低溶液的体积以便于后续操作。通常的处理方法是过柱法，包括离子交换[74]、分子排阻[75]、疏水层析[76]、三链DNA亲和层析[77]；或者通过加入无水乙醇、异丙醇来达到浓缩质粒DNA的目的，但无论是前者还是后者都存在着不足，过柱的速度通常较慢，且质粒DNA的电荷性和疏水性与杂质RNA、内毒素、宿主蛋白都很相似，不易掌握具体的pH和盐浓度；醇类的浓缩需要的体积很大，无疑增加了成本，而且有背于不能使用易燃、易爆物品的原则。因此，其他的浓缩方法应运而生，这包括分子切向流法[80],小分子类物质如精胺[79]、十六烷基三甲基溴化铵[80]、聚电解质[81]等，另外芳香化合物[82]和MnCL2[83]等都有报道。
4.4 宿主细胞中核酸和其他内容物的组成
正常生理状况下，大肠杆菌宿主细胞含有水、核酸、蛋白质、内毒素和小分子和一些离子，其占有含量和种类各不相同，分子量也差异很大，如Atkinson[84]所述，见表。
种类 总量（％W/W） 种类/个细胞 平均分子量
水 70 1 18
核酸
基因组 0.5 1a 2.8×106
转移RNA 4.8 40 28
核糖体RNA 0.9 3 500-1000
信使RNA 0.3 400-800 660-990
质粒DNA <1 1 3300b
蛋白质 15 1100 8-200
内毒素 5 10
小分子和离子 3 800-200 <1
a．快速生长的大肠杆菌细胞中含有4个基因组分子。
b．质粒分子大小为5kb。
4.4.1 RNA
粗制的质粒DNA中，RNA的含量是质粒DNA含量的20倍左右[78]，因此，如何有效地消除RNA尤其是大分子量的核糖RNA和信使RNA十分重要。现今，绝大多数的纯化方法都使用了牛源性的RNase A，这有违于禁止使用动物源性酶制剂的相关条例[85]。2001年，Cooke[86]有使用表达RNase A基因的宿主菌来制备质粒DNA的成功报道，本实验室也有使用大肠杆菌分泌表达的重组牛RNase A来消除RNase A的成功经验（未发表）。David[87] 的试验结果表明在碱性条件下长时间孵育也可以很好地消除RNA，但是根据我们的试验数据，超螺旋质粒DNA的比列严重下降，损害了质粒DNA的质量。此外，37℃利用内源性RNase A也可去除40％的RNA[88]，2M的氯化钙[89]、5M氯化锂[5]等都可成功消除RNA。
4.4.2 蛋白质
粗制质粒中杂蛋白的含量也相当可观，一定数量的杂蛋白除了降低质粒DNA的转染效率外，可引起机体的异源免疫反应，它的去除一直依赖于对人体和环境有污染和腐蚀的苯酚、氯仿。考虑到蛋白的分子量远远比质粒DNA小，Teeters认为可以利用分子量上的巨大差异来去除蛋白质[92]。Russel J [80]和 Wahlund[81]报道利用CTAB或聚电解质与DNA双螺旋大小沟特异结合的特性可以选择性沉淀DNA，而将杂蛋白留在上清中，通过离心就达到去除蛋白的目的。另外，用离子交换层析[91]和亲和层析柱[92]等技术都可以除去蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的，并取得了很好的纯化效果。
4.4.3 内毒素
细菌内毒素是革兰氏阴性菌外膜上的特有结构，在细菌生长、死亡的过程中被释放出来，在质粒制备过程当中，细胞破碎后，大量的内毒素都释放到溶液中[93]。由于内毒素具有极强的热源性，少量的LPS就可以引起发烧、血液循环障碍甚至休克死亡，因此它的去除显得十分地重要[94]。由于内毒素常常形成囊状结构，其分子量与质粒大小相似，而且电荷性与疏水性都与质粒DNA相似，给质粒DNA的纯化带来了很大的麻烦。目前，内毒素的去除方法主要分为三大类：一是非选择性去除，包括活性炭吸附和萃取[95]，利用分子量差异进行的超滤[96]和pH值差异进行的离子交换色谱[97]，这几种方法没有考虑到LPS结构方面的特殊性质，去除效率较低；二是选择性去除，主要是指亲和色谱法，找出适当的配基，将其固载于亲和色谱的基质上合成出亲和介质，即可成为一种高效能、高选择性的LPS吸附剂，这些包括组胺、组胺酸类[98]；多粘菌素B[99]；聚阳离子配基如PEI[100]，聚-L-赖氨酸[101]；荷正电聚合物γ-甲基-L-谷氨酸酯[102]等；三是特异性去除法，这是根据LPS结合蛋白（LBP）的结构和功能，提出的一种内毒素去除的特异性配体。
4.4.4 基因组DNA
符合药物动力学质粒中的宿主基因组DNA的含量必须小于10ng/µg质粒DNA，在发酵至纯化的过程中，由于酶解和机械剪切力的作用，宿主基因组非常易断，而现行的离子交换等各层析法纯化质粒DNA包括了其不能有效去除宿主基因组DNA和内毒素的缺点，在消除基因组DNA的试验中，以Levy[103] 和 Winters[104]的硝酸纤维膜和硅酸钙最为有效。
4.5 质粒纯化策略
氯化铯密度梯度超速离心是质粒纯化的标准分子生物学方法，但此方法耗时，而且难以扩大，并使用了有毒和诱变试剂，不适合用于临床的质粒DNA的生产。虽然目前纯化质粒DNA的技术还很不成熟，但一些方法具有很大的吸引力。从目的上来讲，实验室制备小量的质粒可能更多的从纯度上考虑，但是要大规模生产质粒，除了纯度上的问题，还有过程的可放大性，重现性，成本等诸多问题需解决。
4.5.1 离子交换色谱
离子交换色谱（Ion exchange chromatography, IEC）利用离子交换剂为固定
相，是根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗
脱层析法。鉴于核酸溶液带有多聚阴离子，可以采用阴离子交换色谱的方法纯化
质粒 DNA[105]。DNA 的双螺旋结构使亲水性和疏水性基团分离，疏水性碱基处于双螺旋的内部，两条螺旋形糖-磷酸链缠绕在双螺旋结构的外侧，从而形成多阴离子、高度水化的亲水表面，Stahlberg 等人[106]提出一种量化理论，假定带有多电荷的生物分子和离子交换剂表面间的相互作用，可以看作是两个带电荷表面在与缓冲盐溶液接触时的远距离静电作用，固定相表面是带电荷的基团，使其表面和溶液之间产生了静电势差，从而具有吸引那些带有相反电荷的溶质分子来到表面的能力。
4.5.2 分子排阻色谱
分子排阻色谱，又被称为凝胶过滤，可以用来分离不同大小及具有不同流体力学半径的分子。与阴离子交换树脂不同，用作分子排阻色谱的树脂不和质粒或
者其它杂质结合，该树脂包含有具有确定大小的通道。较小的分子比较大的分子更容易进入这些孔中，并且由此在柱中的流动受到阻碍。既然不用以高浓度的盐或者有机试剂来洗脱质粒，分子排阻色谱的操作显得相对较为简单。洗脱顺序与分子大小顺序相反，最大的分子最先洗出。分子排阻色谱在将质粒DNA从小的RNA片段及被RNA 酶消化的核酸中分离出来显得特别有效，它也能被用于移除质粒溶液中的盐、缓冲液和其它低分子量的化学试剂。分子排阻色谱也可能将质粒从比它更大的 gDNA 分子中分离出来，而且，分子排阻色谱在移除内毒素方面显得很有成效。但分子排阻色谱有相对较低的分辨率，一般要将两种分子达到完全的分离需要这两种分子大小相差至少两倍。因此，在分子大小上与质粒 DNA 相近的染色体 DNA 以及高分子量的 RNA 片段就很难由分子排阻色谱除掉。该基质的排阻极限对蛋白质是 100×106 Da，对线性DNA是20kb，对球状微粒是 400nm。70％的回收率中洗下部分几乎是纯的超螺旋质粒 DNA[107]。
4.5.3 疏水色谱
大肠杆菌gDNA本身是双链DNA，但经碱裂解之后，绝大多数变成了单链，两条链相互分离并部分断裂，因此疏水碱基暴露，在疏水色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography,HIC）过程中，质粒分子的疏水碱基隐藏在双螺旋内部，与配基的作用力非常微弱，另一方面，高浓度的单链核酸，如RNA和变性的gDNA则与配基牢固结合，同样道理，变性的质粒DNA也暴露了疏水碱基，可以通过HIC去除，LPS通过脂基团而与HIC的配体发生作用，而且只有在降低盐离子浓度后方可被洗脱，合成的寡核苷酸进行的试验表明，单链越长，与HIC柱子吸附的时间越长，说明了核酸分子中碱基多少与吸附时间成正相关。Diogo[108]报道通过此方法可以降低内毒素的含量20倍以上，天津大学的Yuan Li[109]等人报道使用HIC来纯化质粒pcDNA3.0也获得了良好的效果。
4.5.4 亲和色谱
亲和层析基于连接在固相支持物上的寡聚核苷和引入目标质粒的特定序列之间形成的三重螺旋结构发展起来[110]。显然，这些支持物对超螺旋构型的质粒的亲和力比对松弛异构体的亲和力高。回收率可高达62％，同时将RNA和gDNA 的含量降低到检测不出的水平。另外，乳糖阻遏蛋白等也能与特殊DNA序列结合的物质小规模纯化质粒。不管是寡聚核苷和质粒结合还是特殊的蛋白和质粒结合，亲和配体和固定相偶联，并同质粒的目标序列相互作用。因为这种结合是依据特定序列的，所以亲和色谱能够高效地将质粒DNA从蛋白质，RNA 和非特定DNA中分离出来。然而，这些方法也只限于小规模的质粒纯化。这主要是因为构建大量的亲和树脂在技术上有困难，同时成本很大。此外， Woodgate[111] 和 Kostal[112] 分别研究了使用锌指结构的GST的序列特异性的层析和以温度诱导金属调节蛋白MerR进行质粒纯化的策略，这两项研究可以丛细胞裂解液中直接纯化质粒DNA，规模可以放大，特异性好，成本也较低，为今后的质粒纯化提供了一定的借鉴。
4.5.5 芳香层析
2003和2004年，Lemmens和Lena M[82，113]先后报道了在高浓度离液剂或水化盐的情况下，使用芳香硫醚为配基的亲硫层析进行了高质量的质粒纯化，其机制可能是包括质粒DNA在内的各种核酸分子在高浓度水化盐如硫酸铵的存在下，各分子发生不同程度的浓缩和结构的改变，而恰恰是这种结构的改变促使超螺旋质粒DNA可以通过π-π作用与配基上的芳香基团结合而被纯化。
4.5.6 去污剂
CTAB 是一种阳离子表面活性剂，它可以与DNA 分子上带有负电荷的磷酸基团发生强烈的静电相互作用，同时，其碳链也可以和 DNA 分子发生疏水互作用，从而中和带电的 DNA 分子使它们从溶液中沉淀下来。向细胞裂解液缓慢地加入CTAB，一方面，可以选择性地沉淀质粒DNA；另一方面，蛋白质、RNA和脂多糖等杂质保持完全溶解的状态。质粒沉淀后，可以往沉淀中加入浓的氯化钠溶液来去除 CTAB。质粒沉淀物中还含有少量 gDNA，但是如果加入的氯化钠的量控制得很精确，就可以只溶解质粒 DNA，而 gDNA 仍然保持沉淀状态。在使用 CTAB 沉淀纯化质粒 DNA 后，质粒的纯度达到 90％，再用盐溶液溶解之后，质粒纯度达到 99％[80]。使用这种方法大规模纯化质粒的关键在于 CTAB 及 NaCl 的加入应该做到精确控制。因此，在线实时检测系统显得必不可少。
2005年，**学者Chowdhury报道使用两性去污剂十二烷基二甲酯氨硫璜丙烷和碱来纯化高质量的质粒DNA[114]，其作用原理可能是去污剂使蛋白分子等杂质随机组装从而形成可见的“软”沉淀，而质粒DNA则通过静电作用被包裹并与杂质形成分离，并由于两性去污剂独特的作用溶解在可溶相中。
4.5.7 浓缩沉淀剂
常规的质粒DNA纯化方法耗时长、使用了吸附剂、核酶和过滤介质等，限制了质粒DNA的规模化提取。1999年，Jamie[115]报道了使用浓缩沉淀剂来选择沉淀质粒DNA的原理，该类沉淀剂是小的阳离子分子，可以与双链DNA的大沟和小沟相结合，缩小DNA体积4-6倍，同时还起到包裹DNA的作用，在其浓缩沉淀质粒DNA的过程中，一般都在低的盐离子下进行。当其与大、小沟上的磷酸基团相互作用，周围的DNA分子都发生浓缩时即可发生沉淀，而且，这些分子不但减少了双螺旋之间的排斥作用，还使其相互连接。
这种应用最早是Hoopes和McClure[116]在用精胺和亚精胺从小分子中沉淀大分子DNA的试验中被证实，最初鲑精DNA，Pbgs19Luxwt（6.0kb）均在低离子浓度下被沉淀，而在600mM的NaCl中未出现沉淀。Mourich[79]于2004年也有用精胺纯化pTH.HM的报道，并比较了其与QIAGEN公司无内毒素试剂盒纯化质粒的转染效率，成本为3.16美元/毫克质粒。
Bloomfield和Shenoy报道的MnCl2[83]与精胺一样，同样可以通过与DNA大小沟结合来分离和纯化质粒DNA。
4.5.8 磁性分离法
2005年，中国台湾的Chen-Li Chiang[117-118]连续报道了使用化学方法制备微小颗粒Fe3O4，并用多聚阳离子聚乙烯亚胺（PEI）包裹，将其置于磁场下，通过顺磁性可以从细菌裂解液中直接纯化质粒DNA，这种磁性颗粒在磁场下，具有磁性强和低毒性的特点，在生物领域备受关注，严格来讲，只有在磁场中，它们才呈现磁性，而且这个特性使得其可重新分散和重复利用。金属可以鳌合氨基酸从而来纯化蛋白，现发现，金属同样可以鳌合暴露出的嘌呤碱基而与单链核酸结合而与质粒DNA分离，Balan[119]等研究证实，用铜载的多聚N－异丙基聚丙酰烯胺和乙烯基咪唑，可以从宿主菌裂解液中特异吸附RNA分子，从而达到纯化质粒DNA的目的，先前质粒DNA的纯化大都依靠吸附、密度或结构差异从基因组DNA、RNA和蛋白质中分离质粒，用金属来分离纯化核酸的报道非常少见，鳌合配基如次氮基三乙酸和亚胺酸与二价金属离子偶联，通过π-d的轨道重叠，与芳香氮具有高亲和力，从而达到纯化效果。
4.5.9 双水相分离质粒DNA
1962年，Albertson[120]是最早利用双相分离法生物分子的研究工作者之一，但是该技术在质粒DNA纯化上的进展缓慢，1978和1991年才由Ohlsson[121]和Cole[122]报道了两个研究报道。直至2002年，Ribeiro[123]系统描述了用PEG/磷酸盐的两相法纯化质粒DNA的报道，并证明用PEG600和PEG1000与磷酸盐组成的两相分离体系的回收率高，杂质少，具有喜人的前景，随后两年，Trindade[124] 和Kepka[125]也分别有用两相分离法纯化质粒DNA的报道。
4.5.10 分子切向流
Tangential flow filtration(TFF)技术主要利用质粒DNA、RNA、基因组DNA等分子的大小不同，滤掉RNA和蛋白质等小分子，而将质粒DNA保留在膜上，使用TFF的主要注意事项是跨膜压、膜孔和缓冲液的传导性。Eon-Duval[78]使用TFF技术成功地纯化了含有乙肝表面抗原基因的质粒（7.7kb），David使用TFF技术纯化了6种质粒DNA，RNA的去除率达99％以上，蛋白质的消除也大于95％。
除了以上列举的方法之外，还有许多改进的纯化策略，如使用膜[126](membrane)和盘[127]（monolith）制作的色谱技术，一改以往柱吸附效率低下，不适合规模化生产的缺点。
五、质量控制及检定的要求
基于质粒 DNA 的生物药剂是高度化学限定的，因此能用化学，生化和物理试剂对其进行分析。为确保产品符合规格而分析所制备的质粒的安全性、效力及纯度是使整个生产流程得以建立的关键问题。评价用作基因治疗和 DNA 疫苗的 DNA 产品的纯度，安全性及效力的主要标准和推荐试剂如下所示：
5.1 产过程中质量监控标准的建立及要求
在生产工艺的各个环节和步骤中对其产品均应建立相应的监控标准，以便后续工艺的进行。由于各种方法的工艺不同，所制定的监控标准和在何步骤进行监控可能不同，但其原则是保证产品的质量、工艺的连续性和稳定性。
5.2 产品的质量检定与要求
外观检查：根据样品的特征建立外观的质量标准，高纯度的质粒DNA呈现生鱼肉透明状，pH一般为7．2±0．5。
纯度：主要是评价纯化的重组DNA制品中是否含有宿主RNA、DNA、内毒素和蛋白的污染。一般采用琼脂糖凝胶电泳的方法检测制品中有无RNA，要求无明显的RNA带型；采用Northernblot或荧光定量PCR的方法检测制品中残留的宿主DNA的含量，在该方法的研究时应建立宿主DNA的标准品，并对该类试剂的敏感性和特异性进行验证。要求DNA制品中残余的宿主DNA含量不超过0.01µg/µg 质粒。可以二辛可宁酸法检测制品中宿主蛋白的残余量，在该方法的研究过程中应建立宿主蛋白的定量标准，并对检测方法的敏感性和特异性进行验证，其性能能满足该实验的要求，宿主蛋白的含量应不超过0.001µg/µg质粒DNA。
可以检测样品在波长为260nm和280nm的紫外吸收值，并计算A260/A280的比值，评价制品的总体纯度，要求其比值在1.75-1.85之间。
质粒大小的均一性和结构的分析：主要是分析超螺旋结构与线性和松弛性质粒的比例，一般采用琼脂糖凝胶电泳的方法对制品进行电泳分析，并用扫描仪对电泳结果进行扫描，分析各带型所占的比例，一般要求环状结构的重组质粒所占的比例在90%以上。
鉴别实验：主要是对重组质粒的特征以及是否含有正确的插入片段进行分析。至少用三对以上限制性内切酶对重组质粒进行酶切，对酶切产物分别进行电泳分析，观察是否有特征性的带型；用PCR方法对插入片段进行扩增或用特征性的酶切方法分析插入的基因片段的大小是否与预计的大小一致。
体外效力实验：体外转染哺乳动物细胞，检测其表达量，需建立定量检测表达抗原的方法以及表达抗原的定量标准，还应检测表达抗原的图谱，其各表达目的抗原的大小应与预计大小相同，应建立相应的方法并进行验证。制定各表达抗原的量和图谱的质量控制标准。
无菌实验：应检测需氧菌、厌氧菌以及支原体等，制品中应无该类微生物的污染。
热原实验：主要检测制品中有无热原物质，可用鲎试剂检测细菌的内毒素，要求内毒素的含量不高于0．1EU/ug；也可以用其它方法如家兔试验检测制品的热源。
抗生素及其它添加物质残余量的检测，由于DNA载体一般使用抗菌素的选择性标记，重组DNA的研制和制备过程中采用含抗菌素的选择性培养基进行培养，在纯化制品中对抗菌素的含量应进行限制，因此，应建立检测抗菌素的检测方法并制定抗生素残留量的要求。
在重组DNA的培养和纯化工艺中，可能需要一些其它物质或基质，如纯化工艺中可能需要乙醇，这些物质可能对人体有潜在的危害，应在纯化制品中限制其含量，因此，应建立检测方法并制定残留量的标准。
安全性实验：该实验是控制该类制品质量的重要指标，由于该制品与一般生物制品相比又有其特殊性，因此，在安全性方面除了考虑一般的安全性实验，还应考虑该制品的特异性安全性。
稳定性实验：由于DNA超螺旋结构的不稳定性，而且超螺旋结构的比例多少可能影响重组DNA的转染率，因此，在该类制品的稳定性实验中应主要考虑超螺旋结构的稳定性。应建立检测超螺旋质粒稳定性实验方法，并建立相应的质量标准。
生物效价：由于用于预防的DNA制剂所发生作用的原理不同，评价其生物效价的方法也不同。如果DNA制剂是通过免疫反应发生作用的，则应评价其体液免疫和细胞免疫的生物效价。在评价体液免疫效价时，应选择实验动物的品系，建立检测动物血清抗体的诊断试剂，并对该类试剂进行验证，可以计算小鼠ED50以及抗体产生的滴度，如有必要和可行，还应当建立评价抗体质量的方法，对抗体的质进行评价；在评价细胞免疫效价时，应当建立检测评价细胞免疫的方法（如特异性CTL反应的方法或Elispot方法等），也可通过对细胞因子的定量检测评价其细胞免疫情况，如属于常规检定项目，该类方法应稳定、重复性好、可操作性强，并制定相应的质量标准。若有动物模型，可进行动物保护性实验。
佐剂或呈递物质的质量评价：如在最终重组DNA制品含有佐剂或呈递物质，则应建立检测该类物质的量以及与重组DNA结合率的方法，并制定质量标准。
六、质粒DNA的应用
伴随着基因工程技术的快速发展，DNA疫苗及基因治疗的优势已被在多个领域证实，而DNA疫苗和基因治疗最终必需是依赖质粒的形式来发挥作用。
6.1 DNA疫苗
DNA疫苗是上世纪九十年代发展起来的新技术，即将外源基因克隆到真核表达载体上构建DNA疫苗质粒，DNA疫苗经过各种途径注射到动物基体内后，可被宿主细胞吸收和摄取，进入宿主细胞的细胞核中转录成mRNA，再在胞浆中翻译成蛋白质。其中一部分蛋白质在降解后与MHCⅠ类分子结合，并被递呈到细胞表面被CD8 T细胞的受体识别，而激活细胞毒T细胞的活性；另一部分蛋白质也可以分泌出去，再像外源蛋白一样被抗原提呈细胞摄取，在吞噬溶酶体内降解成多肽，并进一步与MHCⅡ类分子结合，有抗原提呈细胞提呈到细胞表面被Th2细胞的受体识别，然后由Th2细胞分泌的细胞因子作用于B细胞，而刺激以抗体产生为主的体液免疫[4]。DNA疫苗不仅可诱导产生体液免疫，而且可诱导强烈而持久的细胞免疫，还可避免向外界排毒，而且DNA疫苗与减毒和弱毒疫苗不一样，其不存在毒力反强等问题。其安全性及高效性是传统疫苗所达不到的，所以，该技术在病毒、细胞内寄生所引起的传染病、寄生虫以及肿瘤防治中显示出巨大的潜力。Wolff[128]首先对重组质粒可以在小鼠体内表达进行了报道，外源蛋白可以在小鼠体内表达长达60天，提示质粒DNA可以在体内相当一段时间内进行表达，可以用作治疗性作用，并顿时引起了广泛的研究。
6.2 基因治疗
基因治疗对于癌症、动脉粥样硬化、骨质疏松、关节炎、阿耳茨海默氏病等
因为特定基因活动异常而引起的疾病的预防和治疗很有前景[8]。该疗法是一种将核酸引入人细胞以用来修改它们的遗传特性而达到治疗目的的治疗策略。通常，该核酸是能够编码起治疗作用，破坏作用或者标记作用的蛋白质的双链 DNA分子(dsDNA)。该核酸也可能是与宿主细胞里的目标序列结合，通过阻止 mRNAs或者启动子来抑制特定基因表达的反义 RNA 或者单链 DNA(ssDNA)。
至今，以质粒为基础的基因治疗、癌症疫苗等已经超过了600例，质粒DNA的基因免疫模拟了病原体在细胞内的基因表达途径，已经成功地应用来治疗下肢的局部缺血，心血管再生，并极有希望通过核酸疫苗来预防现代医学的疑难杂症，包括疟疾、艾滋病、乙肝和结核病等。对于基因治疗，质粒不能整合入基因组DNA也许是个缺点，但是质粒可以附加体的形式存在于细胞核中，也可以持续表达相当长的一段时间。
七、质粒DNA的给予途径
用作DNA免疫或基因治疗的一个前提是要有效地将核酸转入靶细胞。并且除了反义疗法外，核酸必须到达细胞核区中。可以通过病毒载体或者非病毒载体将DNA运送到靶细胞的细胞核中。经过遗传改造的病毒载体，如逆转录病毒，腺病毒，单胞疹病毒和其它病毒系统在转运效率上可能比非病毒载体要高，但是由于它们的毒性和免疫原性，以及致癌基因或者肿瘤抑制基因的可能激活和抑制，用病毒载体来传递基因的手段已经引发了安全和规则性的顾虑。所以，非病毒性载体系统变得更加可取，成为商业产品中最具吸引力的基因转移系统[129]。自从 1995 年以来，被批准的用于基因治疗程序中的质粒 DNA 转运载体的数目呈现指数级上升，质粒DNA在正进行的基因治疗试验中占了大约 25％[130]。
大量实验指出，肌肉注射是接种 DNA 疫苗的有效方法，除肌肉细胞外，表皮、粘膜和静脉内注射都可以使外源基因进行表达，产生免疫效果。为了达到好的免疫效果，可将表达重组体包埋于脂质体内进行注射，这种方式比用裸 DNA 直接注射效果好。
八、质粒DNA的安全性问题
质粒DNA已经进入临床试验，在中国，命名为“今又生”的含有p53的基因药物业已上市，该类制品不同于一般的化学药品，药理、毒理和药物动力学的实验要求具有特殊性，因此，该制品的药理学实验主要包括发生作用的原理、生物效价与剂量的关系、免疫程序和接种途径与效果的关系等；在毒理学方面主要考虑接种部位的病理反应、机体产生的抗核酸抗体反应、基因整合和必要时的致瘤性分析等；药代动力学主要包括重组DNA的分布、持续时间等。由于以上各方面互相关联，因此，将药理、毒理和药动力学有关内容联系在一起进行描述。
8.1免疫原性或生物效价的评价
应建立适当的实验及检测方法来评价该类制品的免疫原性或生物效价，如果有动物模型或可建立动物模型，可以采用动物模型直接评价该类制剂的生物效价，如：对一些有动物模型的感染性疾病，可以采用病毒的攻击实验来评价该类制剂的保护效果。而且要建立剂量与生物效价的关系，通过实验优化免疫程序和接种途径。
8.2耐受性以及基因组整合的分析
由于抗原在机体内长期表达可能诱发机体的免疫耐受或产生自身免疫反应，这个问题令科研工作者非常关注，但至今在成年动物中，并没有观察到因接种DNA疫苗而诱发的特异免疫耐受状态。Klinman[131]等用同一DNA疫苗免疫成年小鼠和新生小鼠，结果只在新生小鼠产生了免疫耐受，进一步研究证实，诱导新生小鼠免疫耐受的敏感性随年龄的增大而迅速消失。与Klinman等研究的结果相反，Marta[132用编码疟疾B细胞抗原表位基因的质粒免疫怀孕16天时的母鼠所产新生小鼠是可以产生特异性免疫的，Sechi[133]用含有分枝杆菌M.A.P基因的质粒pEGFP-N1免疫新生羊，也产生了特异性的Th1型细胞免疫应答。众多试验研究表明，免疫耐受的产生与接种质粒DNA没有直接联系，而是与试验动物的种类、接种途径和接种量有关。
由于重组DNA接种到机体以后，由于DNA疫苗免疫调节特征，在试验中发现细菌DNA可刺激正常小鼠产生抗DNA抗体，但随后Martin [134]等在大量不同的研究结果中均表明由常规DNA疫苗诱生的自身抗体水平还不足以导致活动性自身免疫病。此外，Gregor[135]等对无症状的HIV感染者注射DNA疫苗后，也没有检测到抗核酸抗体和临床并发症，因此，大量的动物和人体试验结果表明注射质粒DNA不会诱发自身免疫病。
如果质粒DNA整合到人体基因，可能造成人体基因的断裂或重排而诱发染色体的不稳定性，从而可能产生遗传毒性或致瘤反应。因此，在临床前的研究中应对基因在分布的组织及器官中，尤其是生殖腺系统和免疫系统是否发生整合进行检测的可能性进行分析；对重组DNA在接种部位组织及其它组织、器官的分布和持续时间进行追踪检测分析。如果实验证明重组DNA分布于大部分组织或器官，而且有足够的证据证明是否发生整合作用，或者该类制品将长期用于控制或预防非致命性疾病时，应对该类制品的致瘤性进行研究，尤其在重组DNA中有与人基因同源性很高的序列或有已知的潜在的致瘤性基因序列时，更应采用细胞或裸鼠进行致瘤性分析。就目前的研究而言，Kanellos 等 [136]用重组质粒免疫鱼和猩猩后，用Southern blotting检测，结果没有发现质粒DNA的整合。Martin[137]等用PCR检测质粒DNA肌注后在染色体中的整合情况，结果在1µg基因组中可检测到3-30个拷贝，这相当于自发突变率的三千分之一。
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综述： 质粒DNA生产工艺的研究进展
一、质粒DNA
细菌质粒（plasmid）是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的
遗传成分，除了酵母的杀伤质粒（killer plasmid）是一种RNA质粒之外，迄今所知的所有质粒无一例外地都是属于这种类型的DNA分子[1]，质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代[2]，为了更好地适应细胞的生理特点，质粒主要以细长并具有负超螺旋结构的形式存在于原核细胞中[3]。环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：超螺旋型（SC）质粒DNA；开环型（OC）质粒DNA和线性（L）质粒DNA分子[4]。
用于基因工程改造的质粒载体通常包括复制子、选择标记和目的基因和启动子[5]，为了获得高稳定性、高产量的质粒DNA，在构建质粒DNA时，需仔细从以下几个方面着手考虑。
1. 质粒复制子的选择
Prazeres[6]报道到2010年，以质粒为核心的基因免疫和治疗的市场产值将会超过450亿美元，质粒DNA的需求不断加大。因此，无论从科学还是经济角度出发，在构建DNA疫苗和基因治疗用途的质粒时，为了提高质粒产量，复制子的选择非常关键，目前，绝大多数学者选择拷贝数高且仅需宿主编码蛋白的ColE1复制子[7]。在携带ColE1复制子的质粒中，RNAII是复制的正向调节分子，RNAI是复制的负调节物，另外，由质粒编码的一种Rop/Rom蛋白可提高RNAI与RNAII结合的效率，增强RNAI的负调控作用，因此，Rop/Rom基因缺失至少可使colE1质粒拷贝数提高3至4倍[8]。Yavachev 和 Wang [9-10]研究报道非荷载的转移RNA的二氢尿嘧啶环、反义环和CCA序列可与RNA I或RNAII的环有高度的同源性，从而会影响到质粒DNA的复制，但是其具体机制还有待进一步的研究。
据Minton[11]报道，pUC19系列载体同样被缺失了rop基因，但其与其他缺失rop基因的质粒在拷贝数上的表现却不尽相同，这是由于pUC质粒在RNAII序列上带有一个G到A的点突变，可依温度的不同而改变正向调节分子RNAII的二级结构，Chambers S &Yanisch-Perron C等研究表明在42℃或者45℃下，RNAII似乎折叠成抗RNAI抑制的构型，于是DNA合成的起始加强，结果拷贝数特别高[12-14]。
尽管构建DNA疫苗时普遍使用ColE1类型复制子，但Uhlin B & Remaut E报道的一种由低拷贝发展而来的由温度控制的“失控型”复制子同样具有巨大的应用前景，这种失控的质粒可使质粒DNA大量积聚在大肠杆菌中，其拷贝数可以高达1000[15-16]，Ansorge M和Chao Y证实这种拷贝数已成功地应用来表达大量的重组蛋白[17-18]，尽管“失控型”复制子的优势非常明显，但还没有使用这个类型复制子来构建DNA疫苗的成功例子，至今不清楚什么是导致此种复制子未得到开发的具体原因[19]。
2. 抗性基因的选择
在选择抗生素抗性基因时，由于极少量即可引起部分人群强烈的过敏反应，首先应避免β-内酰胺类抗生素的使用，而应考虑氨基糖苷类的新霉素和卡那霉素[20]，因为这些氨基糖苷类的抗生素在临床上很少使用，且无耳毒性、肾毒性等副作用，所以更为合适[19]。
3. 其他元件的考虑
设计、构建DNA疫苗和基因治疗质粒载体的策略已经十分明显，它除了必须包括一个能使质粒在大肠杆菌中维持、分裂的元件；一个能促使目的基因在机体内表达的元件和选择标记外，还包括其他一些调控元件，以促使转基因的表达和质粒的稳定[21]，这些元件包括真核启动子、终止子及其终止信号等，启动子是外源基因在动物细胞内获得表达的必要前提，常见的有CMVI/E、SV40、EF-1α及UbC和MHCI等，CMV比SV40[22]和UbC[23]等更为有效，其中内含子A更能提高CMVI/E的表达水平[22]，CMV现已被广泛使用在商品化载体上，这对商业开发DNA疫苗来说是十分有帮助的。另外，一些抗原基因本身来源的启动子也可用来构建DNA疫苗，但对于想同时表达多个抗原基因的质粒而言，此种启动子的效果不明显；常用的转录终止子及终止信号包括牛生长激素（BGH）、SV40及人β-珠蛋白。此外，在构建DNA疫苗时，可利用非甲基化的细菌DNA-CpG寡脱氧核苷酸来优化整个质粒，提高DNA疫苗的免疫原性，这是因为真核生物CpG的概率只有原核生物的1/16左右[24]，这种频率上的差异使得其与模式识别受体TLR-9的相互作用，提高了免疫应答水平[25]。
4. 目的基因
在选择和构建质粒DNA时，首先应考虑的是质粒DNA可否整合入宿主基因组，因此，在选择目的基因时，须严格避免目的基因同人类基因组之间具有长片断的同源序列；启动子和终止子同样须认真筛选以严格控制其生物学活性；此外所有构建质粒DNA的过程需要有详细的记录，且附有基因的序列，宿主菌的表型和基因型鉴定[26-32]。
5. 质粒的稳定性
质粒DNA导入宿主细胞后，必将引起宿主菌生理发生改变[33]，质粒的复制增加了宿主菌的负担，引起宿主菌生长速率下降，使得重组工程菌的发酵过程比非重组菌的发酵过程复杂化，进而有可能降低质粒DNA的稳定性；同时，外源基因的插入也会干扰到质粒本身的稳定性，在以大肠杆菌为宿主的发酵过程，还必须考虑到宿主菌的遗传特性[34-36]，判定其是否存在可以降解重组DNA，或者产生引起重组DNA的不稳定性的蛋白酶或其他一些蛋白分子。
5.1 质粒不稳定性的概念
质粒不稳定性，是指工程菌在生长过程中重组质粒发生变化，结果不呈现原有的表型特征。质粒不稳定可分为两类：分离不稳定性和结构不稳定性[37]。分离不稳定是指在细胞分裂中由于缺陷分配引起部分或全部质粒的丢失；结构不稳定则是由于重组质粒DNA上的缺失、插入或重排引起的，质粒的分配不稳定性和结构不稳定性的结果都将使我们得不到预期的质粒产量和质量。如果发生质粒分离不稳定，由于部分重组质粒的丢失，工程菌的发酵过程实际上是工程菌和不含有质粒的宿主菌的混合培养，Imanaka[38]证实在非选择性条件下，含有重组质粒的工程菌的比生长速率（μ+）往往小于宿主细胞的比生长速率(μ-)，经过25代后，培养液中几乎都是无质粒的细胞。
5.2 质粒拷贝数
质粒拷贝数是体现质粒稳定性的一个重要特征，拷贝数首先决定于自身的遗传特性，同时也受到宿主菌生理状况及生长环境的影响，Enberg & Nordstorm[39]研究认为宿主菌生长速率增大，质粒的拷贝数下降，这可能是高比生长速率下，质粒的复制速度跟不上细胞分裂的速度，从而质粒拷贝数不断下降。此外，Koizumi[40]的研究同样证实了营养物质的限制或缺乏也会导致质粒拷贝数的下降。一般来讲，质粒拷贝数对质粒稳定性的影响因质粒的不同而不同，Futcher & Cox[41]对几种质粒的稳定性进行了研究，发现质粒稳定性随着拷贝数的增大而增加，但当质粒拷贝数太高时，质粒也往往不稳定，因多次复制，增加了出差错的机会。
5.3 培养方式对质粒稳定性的影响
培养基对质粒的稳定性也起着非常重要的作用，Caulcott [42]研究表明质粒在以葡萄糖作为碳源时的丢失频率大于以淀粉为碳源的培养基。低温往往有利于重组质粒稳定地遗传，而当温度高于50℃时，重组质粒在分批培养的对数后期和连续培养时均呈现遗传不稳定状态[43]。
5.4 解决办法
在重组基因工程菌发酵过程中，克服质粒丢失的最广泛使用也是最有效的方法就是添加针对抗性基因的抗生素。FDA规定不管在生产还是管理上都应用卡那霉素代替氨苄青霉素，其原因是考虑到β内酰胺类抗生素是一种强烈的过敏原；另外，用抗生素添加法来消除质粒脱落性的不稳定性在大规模生产时并不可取，因为这种选择压力只能维持一段时间，要从根本上解决这个问题，需要研究影响质粒稳定性的各个过程（质粒的复制、质粒的转移及质粒在子代细胞中的分配等）[44]；此外，质粒的平衡致死系统有可能为彻底摒弃抗生素的使用奠定基础[45]。
二、菌种库的建立
对转化大肠杆菌的条件进行优化。建立原始种子库。分析种子库的遗传稳定性，要明确该种子库可以传代的次数。在此基础上建立主细胞库和工作细胞库，并应保证该类细胞库没有噬菌体和其它外源因子的污染；并对细菌的遗传背景进行分析和检测，保证细胞库中细菌的遗传背景包括基因型、表型未发生改变；应检测细菌的形态学，保证细菌的均一性；应检测导入基因的存在状态。并对工作细胞库的规模、保存条件、扩增条件、传代过程中质粒的稳定性（拷贝数及表达量）、允许的传代次数等进行研究。
三、含重组质粒基因工程菌的发酵
影响质粒 DNA 产量的因素最重要的是宿主菌株的遗传背景和质粒分子本身的拷贝数，除此之外，在工业发酵中宿主菌株的生长条件和培养基类型也是不可忽视的条件。一般建议使用 endA 基因发生突变的（endA1）大肠杆菌宿主菌株，例如 DH5α，JM109，以及 XL1-Blue 等，因为 endA 基因突变的结果，使得大肠杆菌宿主细胞失去了合成具有功能活性的核酸内切酶Ⅰ的能力，从而增进了所含质粒 DNA 分子的稳定性[46]。
在典型的分子生物学实验中，质粒是由大肠杆菌在摇瓶中发酵生产的，温度、转速和培养基是唯一可控制的因素[47]。一般培养物的质粒产量在 1-10mg 之间；在高密度培养的发酵罐中，诸如培养基组成、温度、pH 值、溶解氧、积累的代谢产物，搅拌速度等影响细菌及质粒产量的因素都能得到监测和控制，质粒产量可达摇瓶的10到50倍[48]，Lahijani R[49]的研究数据显示每升培养基可以产出220mg质粒DNA，Schmidt T[50]也表明质粒产量可达225mg/L。高密度培养技术的出现，不仅能增加产率，而且也为减少发酵罐容积、减轻分离纯化、减少污水、降低能耗和成本带来好处。
3.1 培养基的组成
大肠杆菌可以在营养丰富或贫乏的培养基中生长，但是营养物的种类及来源对质粒DNA的质量和数量都产生重大影响[51]。由于可生产高的细胞密度，丰富的、复合培养物，如酵母膏和/或蛋白水解物很受欢迎，肉膏因为可能含有疯牛病等动物病毒而成为潜在的污染源被排除在外。除了丰富营养物，还需加入葡萄糖或甘油等碳源物质，Korz[52]研究表明，以甘油为基础的碳源培养基的生长速度较慢，几乎不产生乙酸，终产物也比以葡萄糖为碳源的培养基多，但当它们超过一定的范围时都会阻止细胞的生长，这就解释了为什么在间歇发酵中增加营养物的浓度并不能得到高细胞密度的原因。
目前，常用的有三种形式的培养基：限制性培养基、半限制性培养基和复合培养基，其可重复性依次降低。O’Kennedy[53]的研究结果表明，半限制性培养基生产质粒pSV的产量为9.12μg/mg干菌，比复合培养基的4-6μg/mg干菌高一些。同时， O’Kennedy[54]还证实了用于质粒生产培养基最佳的C︰N为2.78︰1，最大比例不要超过12︰1，因为在此范围内，细菌膜上的肽聚糖的成分没有发生改变，不会影响到化学裂解的特性，在试验过程中，O’Kennedy还发现添加氨基酸后的限制性培养基SDCAS，无论在提高质粒超螺旋的比例上还是在减少质粒的丢失率上都比LB培养基的效果好，且SDCAS经碱裂解后产生的宿主基因组DNA也明显减少。
3.2 发酵方式的选择
发酵一般以分批或者流加的方式进行[55]。在这两种方式中，流加发酵可以提高细胞密度，并因此可能改变质粒的质量，Matsui[56]报道在发酵过程中添加固体葡萄糖，可以使DCW(dry cell weight)达到134g/L，质粒在细胞中一般呈现负超螺旋结构，但据了解，宿主菌的生长条件，溶解氧及温度等的改变都可以改变超螺旋质粒的密度[57]。D.J.Korz[58]研究证实，溶氧不足或CO2过剩都会促进乙酸形成，促使细胞衰老和死亡，降低质粒DNA的产量和质量。
Lahijani[59] 探讨了温度和流加操作对质粒产量的影响，培养物在连续流加操作中保持 37℃直至 OD600达到某个数值后，升温至 42℃或 45℃，这样可大大提高质粒的产量，补料过程中，可尽量使用氨水来调节pH，这样可以补充氮源。也有实验指出质粒的生产因为质粒本身而异，相同发酵条件下不同的质粒产量会有很大差异；但多数研究者认为，控制细菌较低的比生长速率，对质粒的复制有很大的好处，因为，宿主菌过快的直接后果是质粒复制跟不上细菌的生长，导致拷贝数下降或者质粒丢失。理想的质粒收获阶段应该是在细菌生长进入生长对数后期或静止期前期，此时RNA转录，蛋白质翻译的水平处于最低，质粒的复制达到最高水平。
1989年，Reinikainen [60]研究小组得出结论，pH值介于6.2-6.8之间和30℃的培养温度有利于ColE1类型复制子质粒产量的提高，此外，添加氯霉素[61]，氨基酸饥饿[62]，添加痕量维生素[63]等都可以提高质粒DNA的产量。
四、质粒的分离和纯化
在质粒的最终产物中，宿主基因组片段、高分子量的RNA尤其是核糖体RNA和质粒的异构体不利于质粒的基因转染，因此，如何有效消除这些杂质尤为关键。因为质粒DNA的这种带负电荷的多形结构使得它的电荷性和亲水性能够与许多分子如内毒素和杂蛋白相结合，加大了其纯化的难度，虽然目前有很多种方法可用来纯化质粒DNA，但迄今并没有一个相关的标准。
在实验室未优化的条件下，质粒产量通常较低，且提取和制备的质粒DNA损失严重，不符合FDA等相关组织机构的条例。除此之外，质粒的大规模提取要考虑到如何降低生产成本，并按照生物制品评价和研究中心（Center for Biologics Evaluation and Rrsearch, CBER）下属的疫苗研究和管理办公室已有的章程严格执行 [64]。
如前所述，质粒纯化时，主要考虑四种杂质：gDNA，RNA，蛋白质和内毒素。质粒的工业化大规模生产除了要除去这些杂质之外，还应该避免使用有毒，有机、易燃试剂和动物源性的酶试剂[65]。在保证产率和纯度合格的情况下应选择省时、省成本、省纯化工艺的操作流程。所有的操作都应该能够放大到每批生产克级甚至千克级的质粒。最重要的是，所有过程要有重复性，这样才能使生产出的质粒一直符合产品规格。一般的，质粒的大规模纯化包括下面几个或所有步骤：细胞裂解，沉淀，酶消化，柱层析（一步或多步），脱盐或着改变缓冲液，以及无菌过滤。质粒的大规模生产纯化的大致流程如下图所示[66]：
4.1 细胞收集
细胞培养结束后，必须通过连续流或者微过滤[67]对培养菌体进行浓缩，这不仅仅是要对菌体进行浓缩，而且是为了去除对接下来的纯化有影响的培养基成分。
4.2 细胞裂解
细菌细胞裂解是纯化流程中的关键一步。可以通过多种手段来完成细胞的破
碎：机械破碎（珠磨法、渗透压冲击等），酶解法，热裂解和碱裂解法。
4.2.1 机械裂解
关于机械破碎裂解大肠杆菌以释放质粒的研究表明只有微流体化和珠磨法能获得完整的质粒分子。当用微流化器破碎细胞达65％时，质粒最多可以回收35％，而用玻璃珠研磨破碎细胞达50％时质粒分子最多可以回收达74％，用微流化和玻璃珠研磨破碎细胞后，超螺旋质粒在总释放质粒中分别为80％和94％，增加细胞破碎频率将使超螺旋质粒减少至10％以下[68]，绝大多数质粒呈现“smear”形状，为获得相对产量较高的超螺旋质粒必须降低细胞破碎率，因此，在规模化生产上，这些破碎方法并不适用。
4.2.2 热裂解
Zhijun Wang[69]等研究认为热裂解具有不需完全破裂细胞、价格低廉、操作简便快捷等诸多优点，其所需设备一般有蠕动泵、去污剂和循环热水浴等，但是我们的热裂解实验结果表明：靠蠕动泵将悬浮在Triton、EDTA中的菌液循环于沸水浴一段时间后，得到的菌液粘度太大，不易下一步操作，且含有的宿主基因组DNA太多，因此我们放弃了进一步的尝试。
4.2.3 碱裂解
目前最受欢迎的细胞裂解法是由 Birnboim & Doly[70]提出的碱裂解法，它主要是靠0.2M NaOH、 1%SDS和pH4.8的KAC来完成的，它的整个步骤包括我们常说的SolutionI、SolutionII、SolutionIII三步，首先是将菌体悬浮在SolutionI中，其中的EDTA比较关键，它起着两个作用：（1）鰲合细胞膜和骨架上的Ca2+、Mg2+，从而使细胞更易破碎（2）鰲合Mg2+，使得内源性DNase没有Mg2+不能发挥作用，保持质粒DNA的稳定性，另外SolutionI中的Tris起着稳定pH的作用，葡萄糖起着缓冲防止gDNA断裂的作用。SolutionII是非常关键的一步，SDS破坏胞膜，释放菌体内容物，同时也能使绝大多数的蛋白质和脂肪变性并溶解，NaOH使质粒DNA和基因组DNA都变性，而质粒DNA由于有特有的拓扑超螺旋结构，可以在下一步中自然复性，而基因组DNA则永久变性，在这一步中注意事项是在混匀过程中动作必须轻柔，原因是防止局部pH大于13而导致质粒DNA不可逆变性和粗暴操作导致的基因组断裂，局部高浓度的SDS也会形成鬼带（ghoast band）[71]。接下来的是用SolutionIII进行中和，使质粒DNA复性，同时高浓度的KAC也起到了盐析的作用，最终形成的SDS-gDNA-蛋白不可溶复合物而被去除，这一步使得变性的蛋白质和脂质变成不溶的，凝乳状的沉淀，同时一部分染色体 DNA也沉淀出来，而质粒 DNA 仍然呈溶解状态。这是因为染色体 DNA 和一些蛋白质及脂质是部分相连的，而质粒通常没有这种连接状态。在最终的沉淀步骤，考虑到质粒DNA双螺旋结构是由两条带磷酸基的骨架构成，存在着互相排斥的可能性，所有可以在其中加入一些NaCl和NaAC等使得DNA更易沉淀，天气炎热时还可降低温度，以抵消布朗运动效应带来的质粒不易沉淀的后果。
由于SolutionIII中KAC的成本非常昂贵，为了降低生产成本，我们根据溶液III的原理，摸索了许多种新配方，同样也能达到相似的效果，成本却大大降低，为大规模生产质粒DNA提供了有力的保证。
4.2.4 苯酚、氯仿直接抽提法
1999年，Jun Song[72]等人报道了用苯酚和氯仿直接抽提培养菌液来获得质粒DNA的技术，这项技术可以大大节约质粒提取的时间，尤其体现在通量筛选重组克隆时优势明显，但其不能去除宿主基因组DNA。
4.3 质粒制备液的净化和浓缩
在实验室水平上，去除细胞碎片、变性蛋白和核酸沉淀物的办法通常是离心。然而，这并不适用于质粒DNA 的工业化生产。在工业操作中，这应该由被证明是产生剪切力低的操作来完成。这是因为：第一，应避免将染色体 DNA 剪切成片段，否则染色体 DNA 将从沉淀中释放并污染质粒；第二，质粒在分离过程中也要受到剪切，如果质粒分子较大，则可能发生分子链的断裂。工业上的离心机通常采用连续流加方式操作以达到高的处理量。进入离心机的流体所产生的离心加速度可能导致剪切，从而打散已经沉淀的物质和 gDNA。因此，过滤成为比较理想的操作，但是如何防止粘稠的沉淀复合物不堵住过滤孔还是一个复杂的技术难题。
质粒 DNA在大肠杆菌裂解液中只占总核酸的 1%(w/w)[73]，裂解后，仍然存在大量的 RNA 和蛋白质，这些都必须在随后的步骤中被去除，同时应该降低溶液的体积以便于后续操作。通常的处理方法是过柱法，包括离子交换[74]、分子排阻[75]、疏水层析[76]、三链DNA亲和层析[77]；或者通过加入无水乙醇、异丙醇来达到浓缩质粒DNA的目的，但无论是前者还是后者都存在着不足，过柱的速度通常较慢，且质粒DNA的电荷性和疏水性与杂质RNA、内毒素、宿主蛋白都很相似，不易掌握具体的pH和盐浓度；醇类的浓缩需要的体积很大，无疑增加了成本，而且有背于不能使用易燃、易爆物品的原则。因此，其他的浓缩方法应运而生，这包括分子切向流法[80],小分子类物质如精胺[79]、十六烷基三甲基溴化铵[80]、聚电解质[81]等，另外芳香化合物[82]和MnCL2[83]等都有报道。
4.4 宿主细胞中核酸和其他内容物的组成
正常生理状况下，大肠杆菌宿主细胞含有水、核酸、蛋白质、内毒素和小分子和一些离子，其占有含量和种类各不相同，分子量也差异很大，如Atkinson[84]所述，见表。
种类 总量（％W/W） 种类/个细胞 平均分子量
水 70 1 18
核酸
基因组 0.5 1a 2.8×106
转移RNA 4.8 40 28
核糖体RNA 0.9 3 500-1000
信使RNA 0.3 400-800 660-990
质粒DNA <1 1 3300b
蛋白质 15 1100 8-200
内毒素 5 10
小分子和离子 3 800-200 <1
a．快速生长的大肠杆菌细胞中含有4个基因组分子。
b．质粒分子大小为5kb。
4.4.1 RNA
粗制的质粒DNA中，RNA的含量是质粒DNA含量的20倍左右[78]，因此，如何有效地消除RNA尤其是大分子量的核糖RNA和信使RNA十分重要。现今，绝大多数的纯化方法都使用了牛源性的RNase A，这有违于禁止使用动物源性酶制剂的相关条例[85]。2001年，Cooke[86]有使用表达RNase A基因的宿主菌来制备质粒DNA的成功报道，本实验室也有使用大肠杆菌分泌表达的重组牛RNase A来消除RNase A的成功经验（未发表）。David[87] 的试验结果表明在碱性条件下长时间孵育也可以很好地消除RNA，但是根据我们的试验数据，超螺旋质粒DNA的比列严重下降，损害了质粒DNA的质量。此外，37℃利用内源性RNase A也可去除40％的RNA[88]，2M的氯化钙[89]、5M氯化锂[5]等都可成功消除RNA。
4.4.2 蛋白质
粗制质粒中杂蛋白的含量也相当可观，一定数量的杂蛋白除了降低质粒DNA的转染效率外，可引起机体的异源免疫反应，它的去除一直依赖于对人体和环境有污染和腐蚀的苯酚、氯仿。考虑到蛋白的分子量远远比质粒DNA小，Teeters认为可以利用分子量上的巨大差异来去除蛋白质[92]。Russel J [80]和 Wahlund[81]报道利用CTAB或聚电解质与DNA双螺旋大小沟特异结合的特性可以选择性沉淀DNA，而将杂蛋白留在上清中，通过离心就达到去除蛋白的目的。另外，用离子交换层析[91]和亲和层析柱[92]等技术都可以除去蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的，并取得了很好的纯化效果。
4.4.3 内毒素
细菌内毒素是革兰氏阴性菌外膜上的特有结构，在细菌生长、死亡的过程中被释放出来，在质粒制备过程当中，细胞破碎后，大量的内毒素都释放到溶液中[93]。由于内毒素具有极强的热源性，少量的LPS就可以引起发烧、血液循环障碍甚至休克死亡，因此它的去除显得十分地重要[94]。由于内毒素常常形成囊状结构，其分子量与质粒大小相似，而且电荷性与疏水性都与质粒DNA相似，给质粒DNA的纯化带来了很大的麻烦。目前，内毒素的去除方法主要分为三大类：一是非选择性去除，包括活性炭吸附和萃取[95]，利用分子量差异进行的超滤[96]和pH值差异进行的离子交换色谱[97]，这几种方法没有考虑到LPS结构方面的特殊性质，去除效率较低；二是选择性去除，主要是指亲和色谱法，找出适当的配基，将其固载于亲和色谱的基质上合成出亲和介质，即可成为一种高效能、高选择性的LPS吸附剂，这些包括组胺、组胺酸类[98]；多粘菌素B[99]；聚阳离子配基如PEI[100]，聚-L-赖氨酸[101]；荷正电聚合物γ-甲基-L-谷氨酸酯[102]等；三是特异性去除法，这是根据LPS结合蛋白（LBP）的结构和功能，提出的一种内毒素去除的特异性配体。
4.4.4 基因组DNA
符合药物动力学质粒中的宿主基因组DNA的含量必须小于10ng/µg质粒DNA，在发酵至纯化的过程中，由于酶解和机械剪切力的作用，宿主基因组非常易断，而现行的离子交换等各层析法纯化质粒DNA包括了其不能有效去除宿主基因组DNA和内毒素的缺点，在消除基因组DNA的试验中，以Levy[103] 和 Winters[104]的硝酸纤维膜和硅酸钙最为有效。
4.5 质粒纯化策略
氯化铯密度梯度超速离心是质粒纯化的标准分子生物学方法，但此方法耗时，而且难以扩大，并使用了有毒和诱变试剂，不适合用于临床的质粒DNA的生产。虽然目前纯化质粒DNA的技术还很不成熟，但一些方法具有很大的吸引力。从目的上来讲，实验室制备小量的质粒可能更多的从纯度上考虑，但是要大规模生产质粒，除了纯度上的问题，还有过程的可放大性，重现性，成本等诸多问题需解决。
4.5.1 离子交换色谱
离子交换色谱（Ion exchange chromatography, IEC）利用离子交换剂为固定
相，是根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗
脱层析法。鉴于核酸溶液带有多聚阴离子，可以采用阴离子交换色谱的方法纯化
质粒 DNA[105]。DNA 的双螺旋结构使亲水性和疏水性基团分离，疏水性碱基处于双螺旋的内部，两条螺旋形糖-磷酸链缠绕在双螺旋结构的外侧，从而形成多阴离子、高度水化的亲水表面，Stahlberg 等人[106]提出一种量化理论，假定带有多电荷的生物分子和离子交换剂表面间的相互作用，可以看作是两个带电荷表面在与缓冲盐溶液接触时的远距离静电作用，固定相表面是带电荷的基团，使其表面和溶液之间产生了静电势差，从而具有吸引那些带有相反电荷的溶质分子来到表面的能力。
4.5.2 分子排阻色谱
分子排阻色谱，又被称为凝胶过滤，可以用来分离不同大小及具有不同流体力学半径的分子。与阴离子交换树脂不同，用作分子排阻色谱的树脂不和质粒或
者其它杂质结合，该树脂包含有具有确定大小的通道。较小的分子比较大的分子更容易进入这些孔中，并且由此在柱中的流动受到阻碍。既然不用以高浓度的盐或者有机试剂来洗脱质粒，分子排阻色谱的操作显得相对较为简单。洗脱顺序与分子大小顺序相反，最大的分子最先洗出。分子排阻色谱在将质粒DNA从小的RNA片段及被RNA 酶消化的核酸中分离出来显得特别有效，它也能被用于移除质粒溶液中的盐、缓冲液和其它低分子量的化学试剂。分子排阻色谱也可能将质粒从比它更大的 gDNA 分子中分离出来，而且，分子排阻色谱在移除内毒素方面显得很有成效。但分子排阻色谱有相对较低的分辨率，一般要将两种分子达到完全的分离需要这两种分子大小相差至少两倍。因此，在分子大小上与质粒 DNA 相近的染色体 DNA 以及高分子量的 RNA 片段就很难由分子排阻色谱除掉。该基质的排阻极限对蛋白质是 100×106 Da，对线性DNA是20kb，对球状微粒是 400nm。70％的回收率中洗下部分几乎是纯的超螺旋质粒 DNA[107]。
4.5.3 疏水色谱
大肠杆菌gDNA本身是双链DNA，但经碱裂解之后，绝大多数变成了单链，两条链相互分离并部分断裂，因此疏水碱基暴露，在疏水色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography,HIC）过程中，质粒分子的疏水碱基隐藏在双螺旋内部，与配基的作用力非常微弱，另一方面，高浓度的单链核酸，如RNA和变性的gDNA则与配基牢固结合，同样道理，变性的质粒DNA也暴露了疏水碱基，可以通过HIC去除，LPS通过脂基团而与HIC的配体发生作用，而且只有在降低盐离子浓度后方可被洗脱，合成的寡核苷酸进行的试验表明，单链越长，与HIC柱子吸附的时间越长，说明了核酸分子中碱基多少与吸附时间成正相关。Diogo[108]报道通过此方法可以降低内毒素的含量20倍以上，天津大学的Yuan Li[109]等人报道使用HIC来纯化质粒pcDNA3.0也获得了良好的效果。
4.5.4 亲和色谱
亲和层析基于连接在固相支持物上的寡聚核苷和引入目标质粒的特定序列之间形成的三重螺旋结构发展起来[110]。显然，这些支持物对超螺旋构型的质粒的亲和力比对松弛异构体的亲和力高。回收率可高达62％，同时将RNA和gDNA 的含量降低到检测不出的水平。另外，乳糖阻遏蛋白等也能与特殊DNA序列结合的物质小规模纯化质粒。不管是寡聚核苷和质粒结合还是特殊的蛋白和质粒结合，亲和配体和固定相偶联，并同质粒的目标序列相互作用。因为这种结合是依据特定序列的，所以亲和色谱能够高效地将质粒DNA从蛋白质，RNA 和非特定DNA中分离出来。然而，这些方法也只限于小规模的质粒纯化。这主要是因为构建大量的亲和树脂在技术上有困难，同时成本很大。此外， Woodgate[111] 和 Kostal[112] 分别研究了使用锌指结构的GST的序列特异性的层析和以温度诱导金属调节蛋白MerR进行质粒纯化的策略，这两项研究可以丛细胞裂解液中直接纯化质粒DNA，规模可以放大，特异性好，成本也较低，为今后的质粒纯化提供了一定的借鉴。
4.5.5 芳香层析
2003和2004年，Lemmens和Lena M[82，113]先后报道了在高浓度离液剂或水化盐的情况下，使用芳香硫醚为配基的亲硫层析进行了高质量的质粒纯化，其机制可能是包括质粒DNA在内的各种核酸分子在高浓度水化盐如硫酸铵的存在下，各分子发生不同程度的浓缩和结构的改变，而恰恰是这种结构的改变促使超螺旋质粒DNA可以通过π-π作用与配基上的芳香基团结合而被纯化。
4.5.6 去污剂
CTAB 是一种阳离子表面活性剂，它可以与DNA 分子上带有负电荷的磷酸基团发生强烈的静电相互作用，同时，其碳链也可以和 DNA 分子发生疏水互作用，从而中和带电的 DNA 分子使它们从溶液中沉淀下来。向细胞裂解液缓慢地加入CTAB，一方面，可以选择性地沉淀质粒DNA；另一方面，蛋白质、RNA和脂多糖等杂质保持完全溶解的状态。质粒沉淀后，可以往沉淀中加入浓的氯化钠溶液来去除 CTAB。质粒沉淀物中还含有少量 gDNA，但是如果加入的氯化钠的量控制得很精确，就可以只溶解质粒 DNA，而 gDNA 仍然保持沉淀状态。在使用 CTAB 沉淀纯化质粒 DNA 后，质粒的纯度达到 90％，再用盐溶液溶解之后，质粒纯度达到 99％[80]。使用这种方法大规模纯化质粒的关键在于 CTAB 及 NaCl 的加入应该做到精确控制。因此，在线实时检测系统显得必不可少。
2005年，**学者Chowdhury报道使用两性去污剂十二烷基二甲酯氨硫璜丙烷和碱来纯化高质量的质粒DNA[114]，其作用原理可能是去污剂使蛋白分子等杂质随机组装从而形成可见的“软”沉淀，而质粒DNA则通过静电作用被包裹并与杂质形成分离，并由于两性去污剂独特的作用溶解在可溶相中。
4.5.7 浓缩沉淀剂
常规的质粒DNA纯化方法耗时长、使用了吸附剂、核酶和过滤介质等，限制了质粒DNA的规模化提取。1999年，Jamie[115]报道了使用浓缩沉淀剂来选择沉淀质粒DNA的原理，该类沉淀剂是小的阳离子分子，可以与双链DNA的大沟和小沟相结合，缩小DNA体积4-6倍，同时还起到包裹DNA的作用，在其浓缩沉淀质粒DNA的过程中，一般都在低的盐离子下进行。当其与大、小沟上的磷酸基团相互作用，周围的DNA分子都发生浓缩时即可发生沉淀，而且，这些分子不但减少了双螺旋之间的排斥作用，还使其相互连接。
这种应用最早是Hoopes和McClure[116]在用精胺和亚精胺从小分子中沉淀大分子DNA的试验中被证实，最初鲑精DNA，Pbgs19Luxwt（6.0kb）均在低离子浓度下被沉淀，而在600mM的NaCl中未出现沉淀。Mourich[79]于2004年也有用精胺纯化pTH.HM的报道，并比较了其与QIAGEN公司无内毒素试剂盒纯化质粒的转染效率，成本为3.16美元/毫克质粒。
Bloomfield和Shenoy报道的MnCl2[83]与精胺一样，同样可以通过与DNA大小沟结合来分离和纯化质粒DNA。
4.5.8 磁性分离法
2005年，中国台湾的Chen-Li Chiang[117-118]连续报道了使用化学方法制备微小颗粒Fe3O4，并用多聚阳离子聚乙烯亚胺（PEI）包裹，将其置于磁场下，通过顺磁性可以从细菌裂解液中直接纯化质粒DNA，这种磁性颗粒在磁场下，具有磁性强和低毒性的特点，在生物领域备受关注，严格来讲，只有在磁场中，它们才呈现磁性，而且这个特性使得其可重新分散和重复利用。金属可以鳌合氨基酸从而来纯化蛋白，现发现，金属同样可以鳌合暴露出的嘌呤碱基而与单链核酸结合而与质粒DNA分离，Balan[119]等研究证实，用铜载的多聚N－异丙基聚丙酰烯胺和乙烯基咪唑，可以从宿主菌裂解液中特异吸附RNA分子，从而达到纯化质粒DNA的目的，先前质粒DNA的纯化大都依靠吸附、密度或结构差异从基因组DNA、RNA和蛋白质中分离质粒，用金属来分离纯化核酸的报道非常少见，鳌合配基如次氮基三乙酸和亚胺酸与二价金属离子偶联，通过π-d的轨道重叠，与芳香氮具有高亲和力，从而达到纯化效果。
4.5.9 双水相分离质粒DNA
1962年，Albertson[120]是最早利用双相分离法生物分子的研究工作者之一，但是该技术在质粒DNA纯化上的进展缓慢，1978和1991年才由Ohlsson[121]和Cole[122]报道了两个研究报道。直至2002年，Ribeiro[123]系统描述了用PEG/磷酸盐的两相法纯化质粒DNA的报道，并证明用PEG600和PEG1000与磷酸盐组成的两相分离体系的回收率高，杂质少，具有喜人的前景，随后两年，Trindade[124] 和Kepka[125]也分别有用两相分离法纯化质粒DNA的报道。
4.5.10 分子切向流
Tangential flow filtration(TFF)技术主要利用质粒DNA、RNA、基因组DNA等分子的大小不同，滤掉RNA和蛋白质等小分子，而将质粒DNA保留在膜上，使用TFF的主要注意事项是跨膜压、膜孔和缓冲液的传导性。Eon-Duval[78]使用TFF技术成功地纯化了含有乙肝表面抗原基因的质粒（7.7kb），David使用TFF技术纯化了6种质粒DNA，RNA的去除率达99％以上，蛋白质的消除也大于95％。
除了以上列举的方法之外，还有许多改进的纯化策略，如使用膜[126](membrane)和盘[127]（monolith）制作的色谱技术，一改以往柱吸附效率低下，不适合规模化生产的缺点。
五、质量控制及检定的要求
基于质粒 DNA 的生物药剂是高度化学限定的，因此能用化学，生化和物理试剂对其进行分析。为确保产品符合规格而分析所制备的质粒的安全性、效力及纯度是使整个生产流程得以建立的关键问题。评价用作基因治疗和 DNA 疫苗的 DNA 产品的纯度，安全性及效力的主要标准和推荐试剂如下所示：
5.1 产过程中质量监控标准的建立及要求
在生产工艺的各个环节和步骤中对其产品均应建立相应的监控标准，以便后续工艺的进行。由于各种方法的工艺不同，所制定的监控标准和在何步骤进行监控可能不同，但其原则是保证产品的质量、工艺的连续性和稳定性。
5.2 产品的质量检定与要求
外观检查：根据样品的特征建立外观的质量标准，高纯度的质粒DNA呈现生鱼肉透明状，pH一般为7．2±0．5。
纯度：主要是评价纯化的重组DNA制品中是否含有宿主RNA、DNA、内毒素和蛋白的污染。一般采用琼脂糖凝胶电泳的方法检测制品中有无RNA，要求无明显的RNA带型；采用Northernblot或荧光定量PCR的方法检测制品中残留的宿主DNA的含量，在该方法的研究时应建立宿主DNA的标准品，并对该类试剂的敏感性和特异性进行验证。要求DNA制品中残余的宿主DNA含量不超过0.01µg/µg 质粒。可以二辛可宁酸法检测制品中宿主蛋白的残余量，在该方法的研究过程中应建立宿主蛋白的定量标准，并对检测方法的敏感性和特异性进行验证，其性能能满足该实验的要求，宿主蛋白的含量应不超过0.001µg/µg质粒DNA。
可以检测样品在波长为260nm和280nm的紫外吸收值，并计算A260/A280的比值，评价制品的总体纯度，要求其比值在1.75-1.85之间。
质粒大小的均一性和结构的分析：主要是分析超螺旋结构与线性和松弛性质粒的比例，一般采用琼脂糖凝胶电泳的方法对制品进行电泳分析，并用扫描仪对电泳结果进行扫描，分析各带型所占的比例，一般要求环状结构的重组质粒所占的比例在90%以上。
鉴别实验：主要是对重组质粒的特征以及是否含有正确的插入片段进行分析。至少用三对以上限制性内切酶对重组质粒进行酶切，对酶切产物分别进行电泳分析，观察是否有特征性的带型；用PCR方法对插入片段进行扩增或用特征性的酶切方法分析插入的基因片段的大小是否与预计的大小一致。
体外效力实验：体外转染哺乳动物细胞，检测其表达量，需建立定量检测表达抗原的方法以及表达抗原的定量标准，还应检测表达抗原的图谱，其各表达目的抗原的大小应与预计大小相同，应建立相应的方法并进行验证。制定各表达抗原的量和图谱的质量控制标准。
无菌实验：应检测需氧菌、厌氧菌以及支原体等，制品中应无该类微生物的污染。
热原实验：主要检测制品中有无热原物质，可用鲎试剂检测细菌的内毒素，要求内毒素的含量不高于0．1EU/ug；也可以用其它方法如家兔试验检测制品的热源。
抗生素及其它添加物质残余量的检测，由于DNA载体一般使用抗菌素的选择性标记，重组DNA的研制和制备过程中采用含抗菌素的选择性培养基进行培养，在纯化制品中对抗菌素的含量应进行限制，因此，应建立检测抗菌素的检测方法并制定抗生素残留量的要求。
在重组DNA的培养和纯化工艺中，可能需要一些其它物质或基质，如纯化工艺中可能需要乙醇，这些物质可能对人体有潜在的危害，应在纯化制品中限制其含量，因此，应建立检测方法并制定残留量的标准。
安全性实验：该实验是控制该类制品质量的重要指标，由于该制品与一般生物制品相比又有其特殊性，因此，在安全性方面除了考虑一般的安全性实验，还应考虑该制品的特异性安全性。
稳定性实验：由于DNA超螺旋结构的不稳定性，而且超螺旋结构的比例多少可能影响重组DNA的转染率，因此，在该类制品的稳定性实验中应主要考虑超螺旋结构的稳定性。应建立检测超螺旋质粒稳定性实验方法，并建立相应的质量标准。
生物效价：由于用于预防的DNA制剂所发生作用的原理不同，评价其生物效价的方法也不同。如果DNA制剂是通过免疫反应发生作用的，则应评价其体液免疫和细胞免疫的生物效价。在评价体液免疫效价时，应选择实验动物的品系，建立检测动物血清抗体的诊断试剂，并对该类试剂进行验证，可以计算小鼠ED50以及抗体产生的滴度，如有必要和可行，还应当建立评价抗体质量的方法，对抗体的质进行评价；在评价细胞免疫效价时，应当建立检测评价细胞免疫的方法（如特异性CTL反应的方法或Elispot方法等），也可通过对细胞因子的定量检测评价其细胞免疫情况，如属于常规检定项目，该类方法应稳定、重复性好、可操作性强，并制定相应的质量标准。若有动物模型，可进行动物保护性实验。
佐剂或呈递物质的质量评价：如在最终重组DNA制品含有佐剂或呈递物质，则应建立检测该类物质的量以及与重组DNA结合率的方法，并制定质量标准。
六、质粒DNA的应用
伴随着基因工程技术的快速发展，DNA疫苗及基因治疗的优势已被在多个领域证实，而DNA疫苗和基因治疗最终必需是依赖质粒的形式来发挥作用。
6.1 DNA疫苗
DNA疫苗是上世纪九十年代发展起来的新技术，即将外源基因克隆到真核表达载体上构建DNA疫苗质粒，DNA疫苗经过各种途径注射到动物基体内后，可被宿主细胞吸收和摄取，进入宿主细胞的细胞核中转录成mRNA，再在胞浆中翻译成蛋白质。其中一部分蛋白质在降解后与MHCⅠ类分子结合，并被递呈到细胞表面被CD8 T细胞的受体识别，而激活细胞毒T细胞的活性；另一部分蛋白质也可以分泌出去，再像外源蛋白一样被抗原提呈细胞摄取，在吞噬溶酶体内降解成多肽，并进一步与MHCⅡ类分子结合，有抗原提呈细胞提呈到细胞表面被Th2细胞的受体识别，然后由Th2细胞分泌的细胞因子作用于B细胞，而刺激以抗体产生为主的体液免疫[4]。DNA疫苗不仅可诱导产生体液免疫，而且可诱导强烈而持久的细胞免疫，还可避免向外界排毒，而且DNA疫苗与减毒和弱毒疫苗不一样，其不存在毒力反强等问题。其安全性及高效性是传统疫苗所达不到的，所以，该技术在病毒、细胞内寄生所引起的传染病、寄生虫以及肿瘤防治中显示出巨大的潜力。Wolff[128]首先对重组质粒可以在小鼠体内表达进行了报道，外源蛋白可以在小鼠体内表达长达60天，提示质粒DNA可以在体内相当一段时间内进行表达，可以用作治疗性作用，并顿时引起了广泛的研究。
6.2 基因治疗
基因治疗对于癌症、动脉粥样硬化、骨质疏松、关节炎、阿耳茨海默氏病等
因为特定基因活动异常而引起的疾病的预防和治疗很有前景[8]。该疗法是一种将核酸引入人细胞以用来修改它们的遗传特性而达到治疗目的的治疗策略。通常，该核酸是能够编码起治疗作用，破坏作用或者标记作用的蛋白质的双链 DNA分子(dsDNA)。该核酸也可能是与宿主细胞里的目标序列结合，通过阻止 mRNAs或者启动子来抑制特定基因表达的反义 RNA 或者单链 DNA(ssDNA)。
至今，以质粒为基础的基因治疗、癌症疫苗等已经超过了600例，质粒DNA的基因免疫模拟了病原体在细胞内的基因表达途径，已经成功地应用来治疗下肢的局部缺血，心血管再生，并极有希望通过核酸疫苗来预防现代医学的疑难杂症，包括疟疾、艾滋病、乙肝和结核病等。对于基因治疗，质粒不能整合入基因组DNA也许是个缺点，但是质粒可以附加体的形式存在于细胞核中，也可以持续表达相当长的一段时间。
七、质粒DNA的给予途径
用作DNA免疫或基因治疗的一个前提是要有效地将核酸转入靶细胞。并且除了反义疗法外，核酸必须到达细胞核区中。可以通过病毒载体或者非病毒载体将DNA运送到靶细胞的细胞核中。经过遗传改造的病毒载体，如逆转录病毒，腺病毒，单胞疹病毒和其它病毒系统在转运效率上可能比非病毒载体要高，但是由于它们的毒性和免疫原性，以及致癌基因或者肿瘤抑制基因的可能激活和抑制，用病毒载体来传递基因的手段已经引发了安全和规则性的顾虑。所以，非病毒性载体系统变得更加可取，成为商业产品中最具吸引力的基因转移系统[129]。自从 1995 年以来，被批准的用于基因治疗程序中的质粒 DNA 转运载体的数目呈现指数级上升，质粒DNA在正进行的基因治疗试验中占了大约 25％[130]。
大量实验指出，肌肉注射是接种 DNA 疫苗的有效方法，除肌肉细胞外，表皮、粘膜和静脉内注射都可以使外源基因进行表达，产生免疫效果。为了达到好的免疫效果，可将表达重组体包埋于脂质体内进行注射，这种方式比用裸 DNA 直接注射效果好。
八、质粒DNA的安全性问题
质粒DNA已经进入临床试验，在中国，命名为“今又生”的含有p53的基因药物业已上市，该类制品不同于一般的化学药品，药理、毒理和药物动力学的实验要求具有特殊性，因此，该制品的药理学实验主要包括发生作用的原理、生物效价与剂量的关系、免疫程序和接种途径与效果的关系等；在毒理学方面主要考虑接种部位的病理反应、机体产生的抗核酸抗体反应、基因整合和必要时的致瘤性分析等；药代动力学主要包括重组DNA的分布、持续时间等。由于以上各方面互相关联，因此，将药理、毒理和药动力学有关内容联系在一起进行描述。
8.1免疫原性或生物效价的评价
应建立适当的实验及检测方法来评价该类制品的免疫原性或生物效价，如果有动物模型或可建立动物模型，可以采用动物模型直接评价该类制剂的生物效价，如：对一些有动物模型的感染性疾病，可以采用病毒的攻击实验来评价该类制剂的保护效果。而且要建立剂量与生物效价的关系，通过实验优化免疫程序和接种途径。
8.2耐受性以及基因组整合的分析
由于抗原在机体内长期表达可能诱发机体的免疫耐受或产生自身免疫反应，这个问题令科研工作者非常关注，但至今在成年动物中，并没有观察到因接种DNA疫苗而诱发的特异免疫耐受状态。Klinman[131]等用同一DNA疫苗免疫成年小鼠和新生小鼠，结果只在新生小鼠产生了免疫耐受，进一步研究证实，诱导新生小鼠免疫耐受的敏感性随年龄的增大而迅速消失。与Klinman等研究的结果相反，Marta[132用编码疟疾B细胞抗原表位基因的质粒免疫怀孕16天时的母鼠所产新生小鼠是可以产生特异性免疫的，Sechi[133]用含有分枝杆菌M.A.P基因的质粒pEGFP-N1免疫新生羊，也产生了特异性的Th1型细胞免疫应答。众多试验研究表明，免疫耐受的产生与接种质粒DNA没有直接联系，而是与试验动物的种类、接种途径和接种量有关。
由于重组DNA接种到机体以后，由于DNA疫苗免疫调节特征，在试验中发现细菌DNA可刺激正常小鼠产生抗DNA抗体，但随后Martin [134]等在大量不同的研究结果中均表明由常规DNA疫苗诱生的自身抗体水平还不足以导致活动性自身免疫病。此外，Gregor[135]等对无症状的HIV感染者注射DNA疫苗后，也没有检测到抗核酸抗体和临床并发症，因此，大量的动物和人体试验结果表明注射质粒DNA不会诱发自身免疫病。
如果质粒DNA整合到人体基因，可能造成人体基因的断裂或重排而诱发染色体的不稳定性，从而可能产生遗传毒性或致瘤反应。因此，在临床前的研究中应对基因在分布的组织及器官中，尤其是生殖腺系统和免疫系统是否发生整合进行检测的可能性进行分析；对重组DNA在接种部位组织及其它组织、器官的分布和持续时间进行追踪检测分析。如果实验证明重组DNA分布于大部分组织或器官，而且有足够的证据证明是否发生整合作用，或者该类制品将长期用于控制或预防非致命性疾病时，应对该类制品的致瘤性进行研究，尤其在重组DNA中有与人基因同源性很高的序列或有已知的潜在的致瘤性基因序列时，更应采用细胞或裸鼠进行致瘤性分析。就目前的研究而言，Kanellos 等 [136]用重组质粒免疫鱼和猩猩后，用Southern blotting检测，结果没有发现质粒DNA的整合。Martin[137]等用PCR检测质粒DNA肌注后在染色体中的整合情况，结果在1µg基因组中可检测到3-30个拷贝，这相当于自发突变率的三千分之一。
