碱裂解法提取质粒DNA的研究

质粒是存在于细菌染色体外的一个或多个能独立复制并稳定遗传的小型环状双链DNA分子，其分子量一般在0. 2～10kD 范围内。由于质粒分子小，便于分离和提取，可以携带目的基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达。基因克隆实验中常将经改造后的质粒作为运送基因的载体，质粒D2NA提取效率及质量对后续实验步骤(如酶切、连接、转化大肠杆菌与PCR扩增等)的成功与否有着直接的关系，因而高效快速地从细菌细胞中分离纯化质粒具有重要意义[ 1 ] 。目前从细菌中提取质粒DNA多采用碱裂解法，该法操作简便，但若明确其中主要试剂的作用，所提取的质粒DNA 的纯度及质量会更高。笔者通过不同的试剂进行摸索，现将结果报告如下。

1　材料和方法

1. 1　材料

1. 1. 1　实验菌株　使用菌株为大肠杆菌DH5α，菌株内含质粒pB I121，该质粒上克隆一h IL212基因。

1. 1. 2　主要试剂　氨苄青霉素、RNaseA购自华美生物工程公司; DL15000、DL2000核酸分子量标记购自TAKARA公司;其它各种常规化学试剂均为分析纯。

1. 2　方法

1. 2. 1　质粒DNA的提取[ 1 ] 　采用4种不同的方法进行质粒DNA的提取，所用具体试剂见表1:

①挑取单菌落，接种于4. 0mlLB (含氨苄青霉素)液体培养基中， 37℃、250 rpm振荡培养过夜(约12～14h) 。

②取1. 5ml培养物加入Eppendorf管中，室温12000g离心1min，弃上清。

③将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。

④加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀(不要剧烈振荡) ，并将离心管放置于冰上2min。

⑤加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀冰上放置3min。

⑥加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀， 4℃离心。12000g ×10min。

⑦小心移出上清于一新Eppendorf管中，加入2 /3倍体积异丙醇，混匀， 4℃离心12000g×5min。

⑧1. 0ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1 ～2次，沉淀在室温下晾干。

⑨沉淀溶于50μlTE (含RNaseA 20μg/ml) ， 37℃水浴30min 以降解RNA 分子， - 20℃保存备用。

1. 2. 2 　质粒DNA 的定量及杂质检测　各取样品10μl释稀200 倍后，分别测定OD260 和OD280 值，若OD260 /OD280 > 2. 0，表明DNA 中含有RNA杂质。若OD260 /OD280 < 1. 6，表明样品中含有酚或蛋白质。

1. 2. 3　质粒DNA单酶切后的电泳检测[ 2 ] 　分别取四种方法得到的质粒DNA 1μl，进行酶切。反应体系为20μl，在0. 5ml Eppendorf管中依次加入ddH2O，10 ×酶切反应缓冲液， BSA， 1μg质粒DNA，限制性内切酶Sma Ⅰ0. 5μl， 于37℃酶切2h， 加适当loadingbuffer混匀上样， 在0. 8%琼脂糖凝胶上电泳，采用5V / cm的电压，电泳3h， EB染色，取出凝胶置紫外灯下检测，拍照。

1. 2. 4　PCR扩增h IL - 12特异片段　引物为一对能够扩增1613bp的h IL - 12基因的特异性引物: ①上游引物5’- TCC CCC GGG CCA CCA TGG GTC ACCAGC A - 3’; ②下游引物5’- A CCG GAG CTC TTAGGA AGC ATT CAGATA G - 3’。分别取4种方法提取的质粒DNA为模板进行PCR扩增反应， PCR反应体系为20μl 混匀后在下列循环参数下进行扩增:94℃5 min， 72℃6 min。取4μl PCR扩增产物和1μl 溴酚兰上样缓冲液在1. 5%琼脂糖凝胶上电泳，电压4V / cm，电泳2h[ 3 ] 。

2　结果

2. 1　质粒DNA的定量及杂质检测　表2结果显示:是否使用溶液Ⅰ对实验基本上没有影响，溶液Ⅱ中的NaOH直接关系到所提取质粒DNA 的量，溶液Ⅲ中的醋酸钾主要是与SDS (十二烷基硫酸钠)作用生成PDS(十二烷基硫酸钾) ，从而使大部分蛋白质沉淀。

表2　不同方法提取的质粒DNA的吸光度

2. 2　质粒DNA经sma I单酶切后电泳检测　采用四种不同的方法抽提质粒pB I121 (其片段大小为1. 5k2b) ，分别用sma I 37℃酶切2h，琼脂糖凝胶电泳，通过电泳图可以看到:方法3得到质粒DNA的量明显偏少，表明裂解细菌主要试剂是NaOH，而不是SDS，若只用SDS也能抽提得到少量质粒DNA，见图1。

图1　四种方法得到的质粒DNA经sm a I单酶切后电泳图(1， 2， 3， 4: 分别用方法1， 2， 3， 4 所提取的质粒pB I121;M:DL15000Ma rke r)

2. 3　PCR扩增h IL - 12特异片段　四种方法提取的质粒DNA扩增h IL - 12，其基因片段大小为1613bp，方法4提到的质粒没有扩增出h IL - 12，说明此法所提取的质粒DNA含蛋白质较多，见图2。

图2　四种方法提取的质粒DNA PCR扩增结果电泳图(1， 2， 3， 4: 分别用方法1， 2， 3， 4 所提取的质粒pB I121;M:

DL2000Ma rke r)

3　讨论

碱裂解法提取质粒DNA的基本原理是溶液Ⅰ使细胞悬浮并且EDTA可以与Ca² 和Mg² 螯和，抑制DNase的活性，溶液II裂解细菌，变性蛋白质和少量质粒，溶液Ⅲ使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一起被共沉淀，质粒DNA复性^{[ 4 ]} 。因此如果实验中缺少了溶液Ⅰ，用LB 液体培养基代替之也可以，只要在短时间内完成质粒的提取即可。裂解细菌主要是溶液II中的NaOH， 而不是SDS，所以叫碱裂解法，若只用SDS也能抽提得到少量质粒，这是因为SDS也是碱性的，但是它只能破坏少量细菌的细胞膜。另外， NaOH若不是新配制的，可能会由于空气中的CO₂ 与NaOH作用，减弱了其碱性。这一步操作要注意两点:一是，放置时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片段会慢慢断裂^{[ 5 ]} 。二是，混匀动作要轻柔，既保证细菌沉淀在试剂中充分扩散又要避免机械剪切已变性的质粒DNA和染色体基因组DNA。加入溶液Ⅲ后，会有大量的沉淀生成，这是由于要SDS与蛋白质结合后，

SDS与醋酸钾生成了PDS， PDS的溶解度要比SDS低的多，从而使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一起被共沉淀了。若用醋酸钠代替醋酸钾，所得到的沉淀就会大大减少[ 4 ] 。

[参考文献]

[ 1 ] 　黄培堂译Sambrook， Russell编著. 分子克隆实验指南[M ]. 第3版1北京:科学出版社， 2002.

[ 2 ] 　A Zhou， X J iang1X Xu Imp roved alkaline lysismethod forrap id isolation of p lasmid DNA [ J ]. Biotechniques ， 1997，23 (4) : 5922594.

[ 3 ] 　JT L iou， BH Shieh1SW Chen An imp roved alkaline lysis method forminip reparation of p lasmid DNA [ J ]. Prep Bio2 chem Biotechnol， 1999， 29 (1) : 49254.

[ 4 ] 　S Ehrt ，D Schnapp inger. Isolation of p lasmids from Ecoli by alkaline lysis[ J ]. MethodsMolBiol， 2003， 235: 75278.

[ 5 ] 　R Lakshmi， V Baskar， U Ranga. Extraction of superior2 quality p lasmid DNA by a combination ofmodified alkaline lysis and silica matrix[ J ]. Anal Biochem， 1999， 272 ( 1) :1092112.