枯草芽孢杆菌的电转化没有转化子，请指教！
丁香园
3110
我以前做的实验都是通过感受态的转化方法来转化枯草芽孢杆菌的。
但是枯草芽孢杆菌的感受态转化效率比较低。
最近我采用电转化的方法，但是遇到了一个问题：
就是每次电击完毕后，加入复苏缓冲液37度复苏2h后，发现原来还混混的转化液竟然变得澄清了！涂布后一个转化子都没有！不知道是怎么回事？
还有：垂悬菌体必须要温柔吗？我挺用力的，但不至于一个转化子都没有吧？
质粒样品里面的RNA很多有没有影响啊？我的质粒RNA蛮多的。
质粒加多了是不是也会严重影响电转化效率啊？
希望大家给看看，问题出在哪里？谢谢各位！！！
附：
枯草芽孢杆菌电转化方案
1 感受态细胞的制备
1.1 从新鲜培养的平板上接种一单菌落至3 ml B2液体培养基中，试管（17×100 mm）。
1.2 250 rpm，37℃培养过夜（16 h）。
1.3 接种1.5 ml过夜培养的种子至150 ml（装于1L的三角瓶中）新鲜的B2培养基中，200 rpm，37℃培养，至菌数达到～1×108 cells/ml。
1.4 将菌液冰水浴15 min，然后转移至250 ml的离心杯中，12,000 g，5 min，4℃离心收集菌体。
1.5 吸去上清，菌体保持在冰水浴中。
1.6 用250 ml冰冷的无菌水重新垂悬菌体，然后12,000 g，5 min，4℃离心去上清。应该用250 ml的无菌水洗涤2次以上。
1.7 将洗涤后的菌体垂悬于25 ml冰冷的10%的甘油中，转移至30 ml的离心管中，12,000 g，5 min，4℃离心去上清。
1.8 重新将菌体沉淀垂悬于2 ml 10%的甘油之中，细胞浓度～1×1010 cells/ml。
1.9 将感受态细胞分装于1.5 ml的离心管中，每份250 ul，超低温速冻之后，于-70℃保藏。可以保持几个月不失效。
2 电转化
2.1 在一个1.5 ml的离心管中加入DNA样品（5 ng～2 ug，～3 ul）。
2.2 室温下几分钟的时间融化感受态细胞，然后在加好DNA样品的管子中各加入50 ul感受态细胞，抽吸几次混匀。
2.3 室温下温育30 min。
2.4 设置仪器参数。
2.5 将菌体转移到0.2 cm狭缝的电转化杯中，轻弹几下杯子让样品沉到底部。装好杯子。
2.6 电击一次。
2.7 电击完毕取出杯子并立即加入1 ml SMMP溶液（含有亚浓度的相应抗生素）。温和地将其转移至试管（17×100 mm）中，37℃，250 rpm，复苏 1h。
2.8 查看和记录电击参数，时间常数应该在2.5 ms左右，记录场强（kV/cm）。
2.9 涂布相应的LB抗性平板，37℃培养36～48 h。
3 溶液和试剂
3.1 B2培养基：水解酪蛋白10 g，酵母粉25 g，葡萄糖5 g，NaCl 5 g，K2HPO4 1 g，加900 ml去离子水，调pH值到7.5，定容至1 l，灭菌。
3.2 SMMP溶液：55 ml 2×SMM，40 ml 4×PAB，5 ml 10%(w/v)BSA，调pH值到7.0，过滤除菌。
3.3 2×SMM：25 ml 0.2 M的马来酸（顺丁烯二酸）钠盐，40 ml 0.1 N NaOH，调pH值到6.5，加入5 ml 1 M MgCl2，42.7 g 蔗糖，溶解定容至125 ml，过滤除菌。
3.4 4×PAB：牛肉膏6 g，酵母膏6 g，蛋白胨20 g，葡萄糖4 g，NaCl 14 g，K2HPO4 14.72 g，KH2PO4 5.28 g。
3.5 0.2 M马来酸钠盐：11.6 g马来酸酐或者13.7 g马来酸，4 g NaOH，定容至500 ml，灭菌。
3.6 LB培养基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，定容至1000ml，pH为7.2～7.5。
但是枯草芽孢杆菌的感受态转化效率比较低。
最近我采用电转化的方法，但是遇到了一个问题：
就是每次电击完毕后，加入复苏缓冲液37度复苏2h后，发现原来还混混的转化液竟然变得澄清了！涂布后一个转化子都没有！不知道是怎么回事？
还有：垂悬菌体必须要温柔吗？我挺用力的，但不至于一个转化子都没有吧？
质粒样品里面的RNA很多有没有影响啊？我的质粒RNA蛮多的。
质粒加多了是不是也会严重影响电转化效率啊？
希望大家给看看，问题出在哪里？谢谢各位！！！
附：
枯草芽孢杆菌电转化方案
1 感受态细胞的制备
1.1 从新鲜培养的平板上接种一单菌落至3 ml B2液体培养基中，试管（17×100 mm）。
1.2 250 rpm，37℃培养过夜（16 h）。
1.3 接种1.5 ml过夜培养的种子至150 ml（装于1L的三角瓶中）新鲜的B2培养基中，200 rpm，37℃培养，至菌数达到～1×108 cells/ml。
1.4 将菌液冰水浴15 min，然后转移至250 ml的离心杯中，12,000 g，5 min，4℃离心收集菌体。
1.5 吸去上清，菌体保持在冰水浴中。
1.6 用250 ml冰冷的无菌水重新垂悬菌体，然后12,000 g，5 min，4℃离心去上清。应该用250 ml的无菌水洗涤2次以上。
1.7 将洗涤后的菌体垂悬于25 ml冰冷的10%的甘油中，转移至30 ml的离心管中，12,000 g，5 min，4℃离心去上清。
1.8 重新将菌体沉淀垂悬于2 ml 10%的甘油之中，细胞浓度～1×1010 cells/ml。
1.9 将感受态细胞分装于1.5 ml的离心管中，每份250 ul，超低温速冻之后，于-70℃保藏。可以保持几个月不失效。
2 电转化
2.1 在一个1.5 ml的离心管中加入DNA样品（5 ng～2 ug，～3 ul）。
2.2 室温下几分钟的时间融化感受态细胞，然后在加好DNA样品的管子中各加入50 ul感受态细胞，抽吸几次混匀。
2.3 室温下温育30 min。
2.4 设置仪器参数。
2.5 将菌体转移到0.2 cm狭缝的电转化杯中，轻弹几下杯子让样品沉到底部。装好杯子。
2.6 电击一次。
2.7 电击完毕取出杯子并立即加入1 ml SMMP溶液（含有亚浓度的相应抗生素）。温和地将其转移至试管（17×100 mm）中，37℃，250 rpm，复苏 1h。
2.8 查看和记录电击参数，时间常数应该在2.5 ms左右，记录场强（kV/cm）。
2.9 涂布相应的LB抗性平板，37℃培养36～48 h。
3 溶液和试剂
3.1 B2培养基：水解酪蛋白10 g，酵母粉25 g，葡萄糖5 g，NaCl 5 g，K2HPO4 1 g，加900 ml去离子水，调pH值到7.5，定容至1 l，灭菌。
3.2 SMMP溶液：55 ml 2×SMM，40 ml 4×PAB，5 ml 10%(w/v)BSA，调pH值到7.0，过滤除菌。
3.3 2×SMM：25 ml 0.2 M的马来酸（顺丁烯二酸）钠盐，40 ml 0.1 N NaOH，调pH值到6.5，加入5 ml 1 M MgCl2，42.7 g 蔗糖，溶解定容至125 ml，过滤除菌。
3.4 4×PAB：牛肉膏6 g，酵母膏6 g，蛋白胨20 g，葡萄糖4 g，NaCl 14 g，K2HPO4 14.72 g，KH2PO4 5.28 g。
3.5 0.2 M马来酸钠盐：11.6 g马来酸酐或者13.7 g马来酸，4 g NaOH，定容至500 ml，灭菌。
3.6 LB培养基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，定容至1000ml，pH为7.2～7.5。
