【原创】miRNA Northern Blot实验步骤
丁香园
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<strong>miRNA Northern Blot实验步骤</strong></center>
1975年，英国科学家埃德温·迈勒·萨瑟恩（Edwin Mellor Southern）创建了Southern Blot技术用于检测DNA。基于同样的原理，1977年由斯坦福大学的James Alwine、David Kemp和George Stark开发出了用于检测RNA的Northern Blot技术，至今仍然是一种经典的RNA检测技术。
miRNA在不同组织中丰度变化大，例如，miR-133在骨骼肌中表达很高，在心肌中表达低，而在其它组织未检测到。在使用Northern Blot技术检测miRNA的时候，对检测灵敏度要求比较高。给大家推荐一种基于多生物素信号放大的高灵敏度miRNA Northern Blot技术：RNA样本经过凝胶电泳分离后，转移至膜上；目标miRNA的表达通过生物素标记探针进行检测；生物素标记探针包含miRNA互补序列和标签序列两个部分，互补序列与miRNA结合，标签序列则与多生物素信号放大分子结合，实现对低丰度miRNA分子的高灵敏度检测。具体实验步骤如下：
1、RNA样品制备
总RNA的提取可以采取现在比较常用的TRIzol一步法。不要使用带柱子的RNA提取试剂盒，因为除了专门用于提取miRNA的试剂以外，绝大部分柱子无法捕获20nt左右的miRNA。
2、电泳
（1）配制15%的尿素变性PAGE胶，可以先用预冷的0.5XTBE缓冲液作为电泳缓冲液，60V预跑30min。
（2）将样品与RNA loading buffer按比例混合，70℃预热5min，立即放置冰上。
（3）上样前，用缓冲液冲洗点样孔，防止点样孔中的杂质影响电泳。
（4）点样时，使样品均匀铺在点样孔底部或者使用微量进样器直接在靠近点样孔底部的位置点样。
（5）冰浴中，恒压60~80V电泳约1.5h，至溴酚蓝指示带距底部约3cm处。
3、转膜
（1）电泳结束后，取出凝胶，浸入预冷的0.5XTBE缓冲液中。
（2）转膜所用的膜以及滤纸也需用0.5XTBE缓冲液浸湿（也可以事先用0.5XTBE缓冲液浸泡10min）。
（3）组装“三明治”，从负极（黑色）到正极（红色）依次为：滤纸、胶、膜、滤纸。
（4）组装转膜装置，确保装置所有正负极都连接正确。（这一点大多数人都知道，但在实际操作中往往最容易出错）
（5）冰浴中，恒压60V转膜约1h。
（6）转膜后，用紫外交联仪固定RNA。
（7）42℃干燥15min。
4、杂交
（1）将膜放入50ml杂交管（也可使用普通50ml离心管，最好是螺纹旋转口的，不容易漏）中，用水侵润膜（注意将转有RNA的一面朝内，避免产生气泡）。
（2）加入4ml 预热（42℃提前预热）的杂交缓冲液（沿管壁缓慢加入，不要碰到膜），42℃旋转振荡30min。
（3）倒掉溶液，重新加入4ml 预热的杂交缓冲液，同时加入10μl miRNA探针（生物素标记），42℃旋转振荡过夜。
（4）用20ml杂交缓冲液洗膜一次。
（5）倒掉溶液，加入4ml预热的杂交缓冲液，同时加入8μl与miRNA探针配套的“Amplifier”，42℃旋转振荡2h。（这一步是多生物素信号放大技术提高检测灵敏度的关键，如果是普通的试剂则跳过这一步骤）
（6）用20ml杂交缓冲液洗膜一次。
（7）加20ml洗涤缓冲液，42℃旋转振荡30min。
5、信号检测
（1）用镊子将膜从杂交管中取出，放入显色盒（或者是可以容纳整张膜的容器）中，注意不要将膜重叠放置。
（2）用洗涤缓冲液润洗膜。
（3）加入15ml封闭缓冲液，室温振荡30min。
（4）用1ml封闭缓冲液稀释15μl辣根过氧化物酶标记链霉亲和素（Streptavidin-HRP conjugate），加入显色盒中（不要将酶稀释液直接加在膜上），室温继续振荡45min。
（5）倒掉封闭缓冲液，用洗涤缓冲液洗涤三次，每次室温振荡10min。
（6）等体积的混合Substrate A和B。
（7）将膜放在一个平板上，用1ml底物溶液覆盖整张膜。（为了确保底物溶液在整张膜上分布均匀，可以再滴加了底物的膜上覆盖一层塑料薄膜，避免产生气泡），室温放置5min。
（8）化学发光仪检测发光。
使用多生物素信号放大技术，miRNA Northern Blot灵敏度较普通的试剂高出10到100倍（如图，图中标示的样品量为总RNA含量）。
miRNA在不同组织中丰度变化大，例如，miR-133在骨骼肌中表达很高，在心肌中表达低，而在其它组织未检测到。在使用Northern Blot技术检测miRNA的时候，对检测灵敏度要求比较高。给大家推荐一种基于多生物素信号放大的高灵敏度miRNA Northern Blot技术：RNA样本经过凝胶电泳分离后，转移至膜上；目标miRNA的表达通过生物素标记探针进行检测；生物素标记探针包含miRNA互补序列和标签序列两个部分，互补序列与miRNA结合，标签序列则与多生物素信号放大分子结合，实现对低丰度miRNA分子的高灵敏度检测。具体实验步骤如下：
1、RNA样品制备
总RNA的提取可以采取现在比较常用的TRIzol一步法。不要使用带柱子的RNA提取试剂盒，因为除了专门用于提取miRNA的试剂以外，绝大部分柱子无法捕获20nt左右的miRNA。
2、电泳
（1）配制15%的尿素变性PAGE胶，可以先用预冷的0.5XTBE缓冲液作为电泳缓冲液，60V预跑30min。
（2）将样品与RNA loading buffer按比例混合，70℃预热5min，立即放置冰上。
（3）上样前，用缓冲液冲洗点样孔，防止点样孔中的杂质影响电泳。
（4）点样时，使样品均匀铺在点样孔底部或者使用微量进样器直接在靠近点样孔底部的位置点样。
（5）冰浴中，恒压60~80V电泳约1.5h，至溴酚蓝指示带距底部约3cm处。
3、转膜
（1）电泳结束后，取出凝胶，浸入预冷的0.5XTBE缓冲液中。
（2）转膜所用的膜以及滤纸也需用0.5XTBE缓冲液浸湿（也可以事先用0.5XTBE缓冲液浸泡10min）。
（3）组装“三明治”，从负极（黑色）到正极（红色）依次为：滤纸、胶、膜、滤纸。
（4）组装转膜装置，确保装置所有正负极都连接正确。（这一点大多数人都知道，但在实际操作中往往最容易出错）
（5）冰浴中，恒压60V转膜约1h。
（6）转膜后，用紫外交联仪固定RNA。
（7）42℃干燥15min。
4、杂交
（1）将膜放入50ml杂交管（也可使用普通50ml离心管，最好是螺纹旋转口的，不容易漏）中，用水侵润膜（注意将转有RNA的一面朝内，避免产生气泡）。
（2）加入4ml 预热（42℃提前预热）的杂交缓冲液（沿管壁缓慢加入，不要碰到膜），42℃旋转振荡30min。
（3）倒掉溶液，重新加入4ml 预热的杂交缓冲液，同时加入10μl miRNA探针（生物素标记），42℃旋转振荡过夜。
（4）用20ml杂交缓冲液洗膜一次。
（5）倒掉溶液，加入4ml预热的杂交缓冲液，同时加入8μl与miRNA探针配套的“Amplifier”，42℃旋转振荡2h。（这一步是多生物素信号放大技术提高检测灵敏度的关键，如果是普通的试剂则跳过这一步骤）
（6）用20ml杂交缓冲液洗膜一次。
（7）加20ml洗涤缓冲液，42℃旋转振荡30min。
5、信号检测
（1）用镊子将膜从杂交管中取出，放入显色盒（或者是可以容纳整张膜的容器）中，注意不要将膜重叠放置。
（2）用洗涤缓冲液润洗膜。
（3）加入15ml封闭缓冲液，室温振荡30min。
（4）用1ml封闭缓冲液稀释15μl辣根过氧化物酶标记链霉亲和素（Streptavidin-HRP conjugate），加入显色盒中（不要将酶稀释液直接加在膜上），室温继续振荡45min。
（5）倒掉封闭缓冲液，用洗涤缓冲液洗涤三次，每次室温振荡10min。
（6）等体积的混合Substrate A和B。
（7）将膜放在一个平板上，用1ml底物溶液覆盖整张膜。（为了确保底物溶液在整张膜上分布均匀，可以再滴加了底物的膜上覆盖一层塑料薄膜，避免产生气泡），室温放置5min。
（8）化学发光仪检测发光。
使用多生物素信号放大技术，miRNA Northern Blot灵敏度较普通的试剂高出10到100倍（如图，图中标示的样品量为总RNA含量）。
