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丁香园2015-06-29

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15天构建三个重组质粒经验－－态度决定成败－－献给刚刚进入实验室的新战友

前言：

我自己的课题是单克隆抗体的制备及其初步应用，总共花了六个月的时间基本做完。做完了之后我想现在单抗的文章不可能发到比较好的杂志，就想能不能利用剩下的将近一年的时间来再做一个比较好的课题。

下面是从我的试验记录上面摘抄的一部分，也就是构建载体的这一段时间所记录的东西。

第一天：

同实验室的一位同学是做某蛋白上面的一段的免疫活性的研究，我就像我能不能将此蛋白剩下的几段也做出来，然后共同进行免疫活性的研究，这样的文章总要比单抗的文章有档次一些。产生了这个想法之后当天晚上查找此蛋白的全基因序列，然后利用生物信息学软件分析之后初步确定了如何将此蛋白进行分割表达。

第二天：

引物设计（primer5.0），花了一上午的时间，三个引物的评分分别是56、58、62。评分都不太高，但是有那位同学的质粒做模板，做PCR应该不成问题。中午给上海生工发出E-MAIL，合成引物。

第三天：

手工提取质粒，准备PCR之用。提取结束已经接近中午，然后室温放置EP管挥发酒精知道晚上10点左右，跑胶。看到很亮的两条带，由此可见，手工提取的质粒并不比试剂盒提取的质粒差，关键是在操作的过程中要细心，我用的是氛氯仿和氯仿两步抽提，虽然浓度差一点，但是纯度非常好，对于后续的PCR和酶切都是有好处的。还有就是最后那步酒精挥发，一定要彻底，不然对后面的试验有很坏的影响，尤其是酶切。

第四天：

收到上海生工寄来的引物。按说明书将引物配制成为储存液，以及工作液。晚上用普通PCR酶进行第一次PCR，体系和条件就按照taq酶生产厂家上面说的进行操作。由于要做三个PCR，所以东西比较多，一定要小心，千万不要搞混，而且一定要把已经加入的试剂放在一面，没有加入的试剂放在另一面。可以把除taq酶、六条引物之外的其他东西加到一个管子里面在分装到几个EP管里面，这样更均匀些。

第五天：

昨天PCR没出结果。马上用剃度PCR摸条件，总共摸了有7、8个退火温度，其他同上次一样。晚上跑胶，确定最佳退火温度。用普通PCR酶进行PCR反应。

第六天：

PCR出结果。用高保真PCR酶进行PCR。同时酶切空质粒一个小时。晚上跑胶发现PCR结果很好。酶切条带也比较亮。

第七天：

从PCR体系以及酶切质粒体系里面纯化回收DNA。按说明书操作，试剂盒由天根公司购买。晚上将PCR产物进行双酶切，酶切时间4小时。

第八天：

早上纯化回收PCR酶切产物。下午配制氨苄平板。晚上连接一小时。摇一管BL21菌，准备做感受态。直接用表达菌，省略克隆菌一步。

第九天：

下午制备感受态细胞，转化。晚上11点左右，涂板。

第十天：

每个板子上面大约长了40个左右的单克隆菌落。上午10点多，每个板子上面挑4个克隆，放入氨苄的培养基中培养。晚上11点多，取出后没有时间提取质粒了，就放在4度冰箱中过夜。准备明天再提。

第十一天：

将昨天的菌液再放入摇床中摇一个小时。然后手工提取质粒，准备PCR鉴定。提取质粒过程与前面提取质粒过程一摸一样。晚上再次用普通PCR酶做PCR鉴定。

第十二天：

PCR产物与原来扩增的PCR产物大小相同，初步确定转化成功。

第十三天：

重组质粒双酶切鉴定，完全正确。

第十四天：

送上海生工测序。

纯化蛋白我做单抗之前就已经做过了，并不用花多少时间，不论是包含体形式表达的蛋白，还是可溶性形式表达的蛋白。但是为什么就这么一个小小的试验有太多太多的人竟做了一年之久呢？我想主要是态度问题，并没有用心仔细的去考虑过这个试验，没有用心去做这个试验。在做任何试验之前一定要对整个试验有一个全面的了解，有一个全面的认识，然后认认真真的去做每一个小的试验。事情再简单，但是你要想总是能做对也难，就是这个道理。在丁香园里你可以看到大家问的问题太多了，但是为什么不自己去想着解决呢？根据我的PROFILE你可以看到我问的问题很少，不是我没有问题问，而且我的问题相当多，我只是不在这里问罢了，我去自己想，想不明白就看书，实在找不到答案再来这里问有经验的人。

希望上面说到的能给大家，尤其是新战友一点点帮助。

 by 20021108