【共享】很不错的MIRNA检测实验流程
丁香园论坛
3025
一．实验材料及其仪器
1．实验仪器
iQ5 Real Time PCR Detection System： Bio-Rad
2．实验材料及试剂
All-in-OneTM miRNA Q-PCR Detection Kit： GeneCopoeia (Cat. No. R0101S )
验证模板：人源十个不同的组织所制备的cDNA
测试引物：共5 对（具体引物序列等详细信息附在产品说明书处，此处略）
Catalog# Primer ID Mature_Acc Mature_ID PCR SIZE
1 miRQP0227 hsmq-0031 MIMAT0000069 hsa-miR-16 75bp GeneCopoeia
2 miRQP0074 hsmq-0032 MIMAT0000422 hsa-miR-124 73bp GeneCopoeia
3 miRQP0096 hsmq-0034 MIMAT0000423 hsa-miR-125b 75bp GeneCopoeia
4 miRQP0175 hsmq-0035 MIMAT0000429 hsa-miR-137 76bp GeneCopoeia
5 miRQP9901 hsnRNA-U6 M14486 hsnRNA-U6 79bp GeneCopoeia
二：验证流程及其条件
RNA 抽提
1． 样品处理
取一定量的十个不同的人源组织标本至冷冻的研钵中，加入液氮研磨至细粉，最
后转移至有1ml TRIzol 的离心管中，反复振荡约5min。（如为细胞样品，则取约
106~107 左右的细胞数至1ml TRIzol 中，反复吹打至裂解。）
2． 相分离
室温放置10min 左右后，每1ml TRIzol 中加入氯仿为200μl，盖上盖子，剧烈振
荡约1min，室温静置2～5min，然后12000g 冷冻离心15min（6℃），小心取出样品，
通过观察可以发现样品分三层，其中最上层含有RNA 样品。
3． RNA 沉淀
小心吸取上清液约450μl（每1ml TRIzol 的吸取量）至含有600μl 冷冻异丙醇的新
离心管中，混匀，-20℃放置约10min，12000g 冷冻离心10min（6℃）。
4． RNA 洗涤
去上清，加入500μl 冷冻的75％乙醇，弹起沉淀后 12000g 冷冻离心5min（6℃），
去上清，再稍离，吸去上清液。
5． RNA 溶解
风干约5～10min（注意不能风太干，只需要沉淀泛白即可），加入DEPC 水约30μl。
贴上标签后-80℃保存。
6．RNA 浓度测定
吸取1μl 抽提的RNA 用DEPC 水稀释10 倍后，在Nanodrop 上测定RNA 浓度，
以DEPC 水做空白对照，同时记录RNA 浓度及其OD260/OD280。
7．RNA 电泳检测
7.1．变性胶制备
取1g Agarose + 75ml 去离子水煮沸，冷却至70℃左右加入10ml 10×Mops 和15ml
甲醛及EB。倒胶至宽口梳子的胶板上，盖上盖子。
7.2．电泳缓冲液配制(1×Mops)
取50ml 10×Mops ，用去离子水稀释至500ml，倒入电泳槽中，再在电泳缓冲液中
添加EB.
7.3．RNA 样品处理
取RNA 样品3μl，补充DEPC 水至18μl，65℃变性10min 后立即冷却，加入2μl
10×RNA loading buffer 即可电泳
7.4．RNA 电泳
先把RNA 胶放入电泳槽中，100V 作用电泳约5min，再在点样孔中点入处理过的
RNA 样品，100V 左右电泳至溴酚蓝至胶的1/3 处，取胶拍照。
8．RNA 检测结果
8.1. 十个不同组织的RNA 电泳图（取各3μl RNA 样品）：
8.2 RNA 电泳的各泳道所对应的样品及其样品浓度和OD260/OD280
泳道 组织 Conc.(ng/μl) OD260/OD280
1 脑 2385 1.9
2 肺 2430 1.94
3 肝 2521 1.91
4 肾 6444 1.94
5 乳腺 2785 1.87
6 睾丸 2972 1.9
7 胎盘 3515 1.91
8 脾 3344 1.91
9 心脏 3394 1.91
10 胰腺 3101 1.91
注：抽提的RNA 必须含有小分子RNA 才能进行miRNA 的检测，所以所选的试剂盒必须为总RNA
抽提试剂盒或小分子RNA 抽提试剂盒； 同时RNA 抽提的质量是进行下游实验的关键，敬请严
格按照所使用的RNA 抽提试剂盒要求进行抽提，抽提结束后，敬请电泳检测RNA 抽提质量。
miRNA 反转录反应
a. 融解miRNA 反转录所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。
b. miRNA 反转录反应液的配制
在冰上的预冷RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积25μl
试剂组分 体积 终浓度
Total RNA 2μg
2.5U/μl PolyA Polymerase 2.5U
RTase Mix
5×Reaction Buffe
ddH2O(RNase/DNase free) 补至25μl
※ 在反应中使用的total RNA 必须含有小分子RNA。
※ Total RNA 使用量可在1ng～5μg 之间调整, 如使用纯化的小分子RNA，其使用量可在0.1ng～
1μg 之间调整。
c. 反转录反应
混匀配制的反应mix，短暂离心后在37℃反应60min，结束后再进行85℃ 5min 灭
活处理。所得的反转录产物可用灭菌水稀释5 倍进行下游qPCR 实验。
Q-PCR 检测miRNA
1. 融解All-in-OneTM miRNA Q-PCR Detection Kit 中的2×All-in-OneTM Q-PCR mix 上下轻
微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。
2. 冰上进行Q-PCR 反应液的配制（所有miRNA 进行复孔测试，同时进行单孔NTC（No
template control）测试）
试剂组分 体积 终浓度
2×All-in-OneTM Q-PCR Mix 10ul 1×
All-in-OneTM miRNA Q-PCR Primer（2μM）2ul 0.2uM
Universal Adaptor PCR Primer （2μM）2ul 0.2uM
1st strand cDNA（5 倍稀释液） 2ul
ddH2O 4ul
Final Volume 20μL
注：在实验中设计了NTC（No Template Control），其为阴性对照，即用水来代替模板cDNA，其
它试剂不变，从而来质控是否体系有污染；实验中如需更改反应体积，敬请保持最适条件下各
组分的比例；试剂盒中的Rox Reference Dye 使用在需用Rox 校正的仪器，如ABI 的定量PCR
仪
3. 充分混匀Q-PCR 反应液，添加至PCR 反应管中，短暂离心，确保所有试剂到反应管
底部。
4. Q-PCR 反应，使用标准的三步法进行检测（以Bio-Rad 的iQ5 进行实验的设计）
循环数 步骤 温度 时间 检测
1 预变性 95℃ 10min 否
变性 95℃ 10sec 否
40 退火 60℃ 20sec 否
延伸 72℃ 10sec 是
反应结束后，立即进行融解曲线分析
检测温度范围 升温速率 恒温时间 检测
66℃～95℃ 0.5℃/次 6 sec/次
30℃ 30sec
注： 以上的反应条件主要参考的为Bio-Rad 的iQ5 定量PCR 仪器，如使用的为不同公司的定量
PCR 仪，请按照不同的仪器要求，调整延伸时间及其融解曲线分析的条件；各miRNA 的退
火问题可能例有差别，具体请参考测试结果部分。
三：测试结果
1. hsa-miR-16（hsmq-0031 引物）
推荐退火问题：60℃
hsa-miR-16 扩增曲线示意图 hsa-miR-16 融解曲线示意图
2．hsa-miR-124（hsmq-0032 引物）
推荐退火温度：60℃
hsa-miR-124 扩增曲线示意图 hsa-miR-124 融解曲线示意图
3．hsa-miR-125b(hsmq-0034 引物)
推荐退火温度：60℃
hsa-miR-125b 扩增曲线示意图 hsa-miR-125b 融解曲线示意图
4．hsa-miR-137(hsmq-0035 引物)
推荐退火温度：60℃
hsa-miR-137 扩增曲线示意图 hsa-miR-137 融解曲线示意图
5．hsnRNA U6 引物测试
推荐退火温度：60℃
hsnRNA U6 扩增曲线示意图 hsnRNA U6 融解曲线示意图
6. 电泳结果
取5μl PCR 产物进行电泳，胶浓度（3％），所有检测都为两个阳性，一个NTC
其中泳道1 为hsa-miR-16、泳道2 为hsa-miR-124、泳道3 为hsa-miR-125b、泳道4 为
hsa-miR-137、泳道5 为hsnRNA-U6
Real
1．实验仪器
iQ5 Real Time PCR Detection System： Bio-Rad
2．实验材料及试剂
All-in-OneTM miRNA Q-PCR Detection Kit： GeneCopoeia (Cat. No. R0101S )
验证模板：人源十个不同的组织所制备的cDNA
测试引物：共5 对（具体引物序列等详细信息附在产品说明书处，此处略）
Catalog# Primer ID Mature_Acc Mature_ID PCR SIZE
1 miRQP0227 hsmq-0031 MIMAT0000069 hsa-miR-16 75bp GeneCopoeia
2 miRQP0074 hsmq-0032 MIMAT0000422 hsa-miR-124 73bp GeneCopoeia
3 miRQP0096 hsmq-0034 MIMAT0000423 hsa-miR-125b 75bp GeneCopoeia
4 miRQP0175 hsmq-0035 MIMAT0000429 hsa-miR-137 76bp GeneCopoeia
5 miRQP9901 hsnRNA-U6 M14486 hsnRNA-U6 79bp GeneCopoeia
二：验证流程及其条件
RNA 抽提
1． 样品处理
取一定量的十个不同的人源组织标本至冷冻的研钵中，加入液氮研磨至细粉，最
后转移至有1ml TRIzol 的离心管中，反复振荡约5min。（如为细胞样品，则取约
106~107 左右的细胞数至1ml TRIzol 中，反复吹打至裂解。）
2． 相分离
室温放置10min 左右后，每1ml TRIzol 中加入氯仿为200μl，盖上盖子，剧烈振
荡约1min，室温静置2～5min，然后12000g 冷冻离心15min（6℃），小心取出样品，
通过观察可以发现样品分三层，其中最上层含有RNA 样品。
3． RNA 沉淀
小心吸取上清液约450μl（每1ml TRIzol 的吸取量）至含有600μl 冷冻异丙醇的新
离心管中，混匀，-20℃放置约10min，12000g 冷冻离心10min（6℃）。
4． RNA 洗涤
去上清，加入500μl 冷冻的75％乙醇，弹起沉淀后 12000g 冷冻离心5min（6℃），
去上清，再稍离，吸去上清液。
5． RNA 溶解
风干约5～10min（注意不能风太干，只需要沉淀泛白即可），加入DEPC 水约30μl。
贴上标签后-80℃保存。
6．RNA 浓度测定
吸取1μl 抽提的RNA 用DEPC 水稀释10 倍后，在Nanodrop 上测定RNA 浓度，
以DEPC 水做空白对照，同时记录RNA 浓度及其OD260/OD280。
7．RNA 电泳检测
7.1．变性胶制备
取1g Agarose + 75ml 去离子水煮沸，冷却至70℃左右加入10ml 10×Mops 和15ml
甲醛及EB。倒胶至宽口梳子的胶板上，盖上盖子。
7.2．电泳缓冲液配制(1×Mops)
取50ml 10×Mops ，用去离子水稀释至500ml，倒入电泳槽中，再在电泳缓冲液中
添加EB.
7.3．RNA 样品处理
取RNA 样品3μl，补充DEPC 水至18μl，65℃变性10min 后立即冷却，加入2μl
10×RNA loading buffer 即可电泳
7.4．RNA 电泳
先把RNA 胶放入电泳槽中，100V 作用电泳约5min，再在点样孔中点入处理过的
RNA 样品，100V 左右电泳至溴酚蓝至胶的1/3 处，取胶拍照。
8．RNA 检测结果
8.1. 十个不同组织的RNA 电泳图（取各3μl RNA 样品）：
8.2 RNA 电泳的各泳道所对应的样品及其样品浓度和OD260/OD280
泳道 组织 Conc.(ng/μl) OD260/OD280
1 脑 2385 1.9
2 肺 2430 1.94
3 肝 2521 1.91
4 肾 6444 1.94
5 乳腺 2785 1.87
6 睾丸 2972 1.9
7 胎盘 3515 1.91
8 脾 3344 1.91
9 心脏 3394 1.91
10 胰腺 3101 1.91
注：抽提的RNA 必须含有小分子RNA 才能进行miRNA 的检测，所以所选的试剂盒必须为总RNA
抽提试剂盒或小分子RNA 抽提试剂盒； 同时RNA 抽提的质量是进行下游实验的关键，敬请严
格按照所使用的RNA 抽提试剂盒要求进行抽提，抽提结束后，敬请电泳检测RNA 抽提质量。
miRNA 反转录反应
a. 融解miRNA 反转录所需的试剂，上下轻微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。
b. miRNA 反转录反应液的配制
在冰上的预冷RNase free 的反应管内加入以下试剂至总体积25μl
试剂组分 体积 终浓度
Total RNA 2μg
2.5U/μl PolyA Polymerase 2.5U
RTase Mix
5×Reaction Buffe
ddH2O(RNase/DNase free) 补至25μl
※ 在反应中使用的total RNA 必须含有小分子RNA。
※ Total RNA 使用量可在1ng～5μg 之间调整, 如使用纯化的小分子RNA，其使用量可在0.1ng～
1μg 之间调整。
c. 反转录反应
混匀配制的反应mix，短暂离心后在37℃反应60min，结束后再进行85℃ 5min 灭
活处理。所得的反转录产物可用灭菌水稀释5 倍进行下游qPCR 实验。
Q-PCR 检测miRNA
1. 融解All-in-OneTM miRNA Q-PCR Detection Kit 中的2×All-in-OneTM Q-PCR mix 上下轻
微颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。
2. 冰上进行Q-PCR 反应液的配制（所有miRNA 进行复孔测试，同时进行单孔NTC（No
template control）测试）
试剂组分 体积 终浓度
2×All-in-OneTM Q-PCR Mix 10ul 1×
All-in-OneTM miRNA Q-PCR Primer（2μM）2ul 0.2uM
Universal Adaptor PCR Primer （2μM）2ul 0.2uM
1st strand cDNA（5 倍稀释液） 2ul
ddH2O 4ul
Final Volume 20μL
注：在实验中设计了NTC（No Template Control），其为阴性对照，即用水来代替模板cDNA，其
它试剂不变，从而来质控是否体系有污染；实验中如需更改反应体积，敬请保持最适条件下各
组分的比例；试剂盒中的Rox Reference Dye 使用在需用Rox 校正的仪器，如ABI 的定量PCR
仪
3. 充分混匀Q-PCR 反应液，添加至PCR 反应管中，短暂离心，确保所有试剂到反应管
底部。
4. Q-PCR 反应，使用标准的三步法进行检测（以Bio-Rad 的iQ5 进行实验的设计）
循环数 步骤 温度 时间 检测
1 预变性 95℃ 10min 否
变性 95℃ 10sec 否
40 退火 60℃ 20sec 否
延伸 72℃ 10sec 是
反应结束后，立即进行融解曲线分析
检测温度范围 升温速率 恒温时间 检测
66℃～95℃ 0.5℃/次 6 sec/次
30℃ 30sec
注： 以上的反应条件主要参考的为Bio-Rad 的iQ5 定量PCR 仪器，如使用的为不同公司的定量
PCR 仪，请按照不同的仪器要求，调整延伸时间及其融解曲线分析的条件；各miRNA 的退
火问题可能例有差别，具体请参考测试结果部分。
三：测试结果
1. hsa-miR-16（hsmq-0031 引物）
推荐退火问题：60℃
hsa-miR-16 扩增曲线示意图 hsa-miR-16 融解曲线示意图
2．hsa-miR-124（hsmq-0032 引物）
推荐退火温度：60℃
hsa-miR-124 扩增曲线示意图 hsa-miR-124 融解曲线示意图
3．hsa-miR-125b(hsmq-0034 引物)
推荐退火温度：60℃
hsa-miR-125b 扩增曲线示意图 hsa-miR-125b 融解曲线示意图
4．hsa-miR-137(hsmq-0035 引物)
推荐退火温度：60℃
hsa-miR-137 扩增曲线示意图 hsa-miR-137 融解曲线示意图
5．hsnRNA U6 引物测试
推荐退火温度：60℃
hsnRNA U6 扩增曲线示意图 hsnRNA U6 融解曲线示意图
6. 电泳结果
取5μl PCR 产物进行电泳，胶浓度（3％），所有检测都为两个阳性，一个NTC
其中泳道1 为hsa-miR-16、泳道2 为hsa-miR-124、泳道3 为hsa-miR-125b、泳道4 为
hsa-miR-137、泳道5 为hsnRNA-U6
Real
