【原创】DNA连接 经验总结与分享 （新版）
丁香园论坛
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此贴是本人在2008年的一篇原创帖子“连接经验分享”主体基础上更新、完善而来的版本。6年的时间让我从研究生变成了老师，一路走来，颇多感慨。丁香园一直是一个好伙伴，我也从新人变成了铁杆战友。前些天有人让我给学生讲讲分子克隆技术，就翻出这篇连接经验，完善后讲给学生，仍然很受欢迎。岁月改变了我们的生活和容颜，而不变的是那些历久弥新的经验之谈。讲完之后我就想，要把这篇新版“连接经验”重新发到丁香园上来，来帮助广大战友多获成果、少走弯路，来感谢丁香园长久以来伴随我们成长。祝丁香园越办越好！
分子克隆过程中出现问题最多的大概就是连接了，大家抱怨的也最多，我也曾陷入在个步骤上。经过长期的摸索我在连接这个问题上有一些体会，在这里跟大家分享一下我的经验，以供陷入困境及刚开始做克隆的同学参考。
关于连接的提问多集中在连接的体系、DNA的用量、vector和insert的比例、连接酶等。但是我认为，连接不成功，问题并不一定出在连接这步上。有很多环节影响连接的成败，如酶切的好不好、回收的质量好坏、连接时的浓度或比例、感受态等。以下我详细说明。
1，PCR引物的设计。通俗的不说，需要指出的是设计引物时一定要考虑切点的甲基化问题。做普通的克隆会涉及到甲基化形式有两种：dam甲基化和dcm甲基化。常用的大肠杆菌都有这两种甲基化酶。dam甲基化酶识别GATC位点并甲基化；dcm甲基化酶识别CCWGG位点（W是A或T）并甲基化。如果有这两种位点那么多数情况内切酶是切不开了。容易受甲基化影响的内切酶有：Dpn1（GA/TC）天生就甲基化；Cla1（ATC/GAT）如果前面加个G或后面加个C那么恭喜你，dam甲基化；Xba1（T/CTAGA）如果前面加个GA或后面加个TC也是dam甲基化，等等有好多。这些容易甲基化的切点设计引物时一定要注意，避免引入甲基化位点。如果真是避免不了或者后来才发现问题，那么把甲基化的质粒转化到甲基化酶缺陷型大肠杆菌中再提质粒就没有甲基化，可以切了。甲基化缺陷型菌有：DM1（Invitrogen）、INV110（invitrogen）、JM110等。
2，PCR产物。两种方式：一种纯化后直接酶切连接；一种连TA克隆载体再往下切连接。我个人强烈建议没有把握的同学用第二种，连TA克隆载体。因为PCR产物直接酶切我觉得有两个缺点：①由于两头把手太短，虽说有保护碱基，但我觉得还是不如从质粒上往下切好切，而且容易切坏、切碎；②无法从电泳上看出来切没切开，因为也就切下了几个十几个bp，带形没啥变化。连TA克隆载体的优点：①进载体后，大提一次的质粒夸张点说够用一辈子的，不用总PCR往出调了，再说PCR那东西还不太稳定，一把多一把少的。②酶切会很清晰，切下来了就是有带，没切动就是没有，没连上也能知道不是没切开而是别的步骤有问题。连TA克隆载体也有些麻烦的地方，如需要的切点有时跟T载体上自带的切点冲突，这就要小心鉴别；而且连T载体最好测序看一下PCR的产物对不对、切点对不对。总体来讲连TA克隆载体是很有优势的。
3，提质粒。建议用柱式提取或大提，保证质粒纯度。提取后测定浓度，核酸的实验配比都要精确定量。
4，酶切。用于连接的酶切很关键。需注意如下几点：
①如果是双酶切A和B，预实验中必须做A和B各自的单酶切和A+B的双酶切,好确认这几种酶都好用，质粒上的切点都好用。如果切不开就要考虑是不是酶的问题，buffer的问题，质粒上有没有这些切点，序列是否甲基化等。
②酶切尽量用大体系，如50ul、100ul等。大体系能稀释内切酶包装中的甘油，对反应有利。相反，连接尽量用小体系10-20ul，以增加DNA末端的碰撞机会。
③如果要回收、连接，酶切用的DNA量我的经验是不用太大，以0.5-2ug为宜。大了会有2个弊端：（1）切割不完全，不是所有的DNA都被酶切，有剩余的未参加反应的；（2）容易切碎，形成一些不规则的末端，不利于连接。
④加入的酶量要与DNA量相匹配，否则且不完全或非特异切割。经验用量0.5-1 ug DNA：0.3-0.5ul 酶；1-2ug DNA：0.5-1ul 酶。
⑤酶切后的电泳，即切胶的那次电泳中，如果切成的条带很清晰，不拖泥带水，没有弥散，没有拖尾，那做回收、连接效果最好。相反，若有弥散、拖尾、不清楚、一团亮等情况就是切的不好，做后续实验成功率会降低。若效果很差建议改进体系重新切。
5，回收。用柱式试剂盒回收。回收后要测DNA浓度，还要电泳，为了看回收DNA的质量。若条带有弥散，即自目的条带以下有拖痕，不是清晰利落的一条带，则质量不好。因为条带拖痕表示它已碎裂成比它小的各种长度的片段，而主带虽然还在那个位置但也已遭到一定程度的破坏。质量不好的回收产物做连接成功率会降低，假阳性克隆会增加。造成回收质量差的原因可能是回收这步，也可能是酶切那步，如果酶切那步出现酶切④所描述的情况，就容易造成回收质量不好。只有回收到清晰、利索的条带，才不影响连接。
6，感受态。做连接要求感受态的效率要高。感受态的感受效率一般刚制备完时是最高的，以后逐渐减弱，而且每次开－80℃冰箱温度微升对感受态效率都有一定影响，久而久之效率就不行了，这就要求大家取感受态时动作迅速、最大程度减少感受态盒升温。都知道感受态效率高好，但麻烦的是感受态效率的高低不好通过实验来检测，因为若通过转质粒来检测，只要是效率中等的感受态都能长出很多克隆。所以如果你们的感受态已经储存了很长时间或者连接长的克隆连续几把都太少就要用新感受态了。感受态可以购买，也可以制备。制备感受态不推荐新手直接去做，最好由经验丰富者做或他带你做。用新做的感受态转质粒，用同样手法用量，你会发现比旧感受态明显多长很多克隆。
7，连接。最后才轮到连接。连接的问题讨论的是比较多的。如果前述若干步骤所得产物质量好，连接不会很难。
①DNA的量：DNA总量有几十ng就能连接成。当然如果你的DNA质量好，DNA用量越大连接效率越高。就怕你为了追求DNA数量而降低了质量，那可就得不偿失了。
②vector和insert的比例：配比的好就相当于增加两条核酸链末端碰撞的机会。如果insert不长（2kb以下）、vector是insert的几倍长，可以用1：3－1：9。如果insert较长（3、4kb以上）、vector和insert长度相似或insert比vector还长，可以用1：1－1：3。短片段的连接相对容易，做的好可以挑到好多正确的克隆。长片段的连接效率稍低。怎么计算：
③体系体积：通常用10-20ul。体系中尽量少含有EDTA，因为会抑制酶活。对于新手，为了提高连接成功率，在满足DNA配比的前提下尽量多地提高两种DNA总量，甚至整个体系都由DNA补齐。
④T4连接酶：酶这东西自然是越贵越好，一分钱一分货，而且连接酶控制着整个分子克隆过程的瓶颈——连接，强烈建议买好的。我用过Promega的，还好；BBI的凑合用。如果连长片段就加二倍的连接酶。
⑤连接时间：按说明书。普通连接酶过夜。
⑥连接温度：最适是16℃。可以用PCR仪设定，或将大量水加少量冰放在泡沫冰盒里调制，扣盖。特殊的参照说明书。
⑦转化：连接的转化不能像转质粒那么随便，要尽量小心，连接体系全都转化进去，减少损失。一般所用的感受态细菌的体积最少是连接体系的5倍。长片段的连接转化时摇菌2小时。
⑧对照：对照很关键，可以反映出很多重要的信息，不要懒，你的连接若是问题不少，就要乖乖的做对照。一般有如下几种对照方式：
⑴转化质粒对照。质粒要微量，如1ng或更少。和连接产物同样抗性、一起转化、涂在同一个板上。这个对照目的是检测转化系统是否有效，即抗生素是否有效、板子是否有效、转化的手法是否正确、以及感受态的效率如何（这需要你每次转化质粒都用相同的手法、用量，看长的菌落数，若明显太少就要怀疑感受态）。还有一个作用，如果质粒早就长出来了，都长挺大了你的连接产物还没动静呢，那八成是没戏了，别等了赶快去准备下次连接的材料吧。
⑵切完回收的vector直接转化对照。如果你是双酶切，切完的vector和没切的vector的长度相差不大，或跑电泳这两种跑不很开，就要做这个对照。目的是看切的是否彻底，是否还有环状质粒存在。长不出克隆是对的，若长出克隆，好好改进你的酶切体系吧。
⑶切完回收的vector加连接酶自身连接再转化做对照。双酶切的，最好要做这个对照，而且这个对照长的克隆要挑若干提质粒。一、若切完的目的vector和没切的vector的长度相差较大，电泳条带离的远，这个对照能检测酶切和回收的质量。如果DNA末端遭破坏或断裂，会随机产生各种末端，这些末端少数能连接到一起，长度上小于等于回收的vector。二、若切完的vector和没切的vector的长度相差不大，这个对照除了检测“一”中所说的还检测是否有只进行了单酶切的。总之不长克隆或只长很少是对的，长多了还是去改进上游的步骤吧。
8，连接产物鉴定
①酶切谱。想迅速地知道结果的和测序不出来的时候做。有几种：连接所用的酶双酶切、backbone上的某一切点（insert中没有）单酶切（目的是看全长对不对）、backbone上和insert上各一个切点的酶单切（切出两条带，进一步鉴定insert的正确性，或TA克隆的方向）。注意，一定要将切后的产物和未切的质粒一起跑电泳，此举是为了证明是否进行了切割。
②测序。凡是要进行后续克隆、表达的连接质粒一定要测序。操作区要通测：即测序反应要覆盖所有的insert长度（一般一个测序反应的有效长度是700-800bp），和连接所用的酶切位点之外的序列（为了鉴定这个位点的完整性、以及外部原件如Cozak序列、终止密码子的完整性）。
如果上面的各步都注意到了而且做的很好，那成功率会较高，但也不能保证一次成功。在确保各步骤产物质量都不错的前提下若重复2-3次还没连上就要回头仔细检查这个克隆的策略有没有问题了。
总结起来有三点：一是设计准确，设计和策略是一切的前提；二是别偷懒，多做准备工作和对照；三是要量化，从酶切、回收到配比。做一个粗略的比喻，每做到一个细节，可能对连接成功率的提升只有5%，但是若做到8-10个细节，对成功率的提升是40-50%。
最后祝愿大家都能顺利完成连接反应！
分子克隆过程中出现问题最多的大概就是连接了，大家抱怨的也最多，我也曾陷入在个步骤上。经过长期的摸索我在连接这个问题上有一些体会，在这里跟大家分享一下我的经验，以供陷入困境及刚开始做克隆的同学参考。
关于连接的提问多集中在连接的体系、DNA的用量、vector和insert的比例、连接酶等。但是我认为，连接不成功，问题并不一定出在连接这步上。有很多环节影响连接的成败，如酶切的好不好、回收的质量好坏、连接时的浓度或比例、感受态等。以下我详细说明。
1，PCR引物的设计。通俗的不说，需要指出的是设计引物时一定要考虑切点的甲基化问题。做普通的克隆会涉及到甲基化形式有两种：dam甲基化和dcm甲基化。常用的大肠杆菌都有这两种甲基化酶。dam甲基化酶识别GATC位点并甲基化；dcm甲基化酶识别CCWGG位点（W是A或T）并甲基化。如果有这两种位点那么多数情况内切酶是切不开了。容易受甲基化影响的内切酶有：Dpn1（GA/TC）天生就甲基化；Cla1（ATC/GAT）如果前面加个G或后面加个C那么恭喜你，dam甲基化；Xba1（T/CTAGA）如果前面加个GA或后面加个TC也是dam甲基化，等等有好多。这些容易甲基化的切点设计引物时一定要注意，避免引入甲基化位点。如果真是避免不了或者后来才发现问题，那么把甲基化的质粒转化到甲基化酶缺陷型大肠杆菌中再提质粒就没有甲基化，可以切了。甲基化缺陷型菌有：DM1（Invitrogen）、INV110（invitrogen）、JM110等。
2，PCR产物。两种方式：一种纯化后直接酶切连接；一种连TA克隆载体再往下切连接。我个人强烈建议没有把握的同学用第二种，连TA克隆载体。因为PCR产物直接酶切我觉得有两个缺点：①由于两头把手太短，虽说有保护碱基，但我觉得还是不如从质粒上往下切好切，而且容易切坏、切碎；②无法从电泳上看出来切没切开，因为也就切下了几个十几个bp，带形没啥变化。连TA克隆载体的优点：①进载体后，大提一次的质粒夸张点说够用一辈子的，不用总PCR往出调了，再说PCR那东西还不太稳定，一把多一把少的。②酶切会很清晰，切下来了就是有带，没切动就是没有，没连上也能知道不是没切开而是别的步骤有问题。连TA克隆载体也有些麻烦的地方，如需要的切点有时跟T载体上自带的切点冲突，这就要小心鉴别；而且连T载体最好测序看一下PCR的产物对不对、切点对不对。总体来讲连TA克隆载体是很有优势的。
3，提质粒。建议用柱式提取或大提，保证质粒纯度。提取后测定浓度，核酸的实验配比都要精确定量。
4，酶切。用于连接的酶切很关键。需注意如下几点：
①如果是双酶切A和B，预实验中必须做A和B各自的单酶切和A+B的双酶切,好确认这几种酶都好用，质粒上的切点都好用。如果切不开就要考虑是不是酶的问题，buffer的问题，质粒上有没有这些切点，序列是否甲基化等。
②酶切尽量用大体系，如50ul、100ul等。大体系能稀释内切酶包装中的甘油，对反应有利。相反，连接尽量用小体系10-20ul，以增加DNA末端的碰撞机会。
③如果要回收、连接，酶切用的DNA量我的经验是不用太大，以0.5-2ug为宜。大了会有2个弊端：（1）切割不完全，不是所有的DNA都被酶切，有剩余的未参加反应的；（2）容易切碎，形成一些不规则的末端，不利于连接。
④加入的酶量要与DNA量相匹配，否则且不完全或非特异切割。经验用量0.5-1 ug DNA：0.3-0.5ul 酶；1-2ug DNA：0.5-1ul 酶。
⑤酶切后的电泳，即切胶的那次电泳中，如果切成的条带很清晰，不拖泥带水，没有弥散，没有拖尾，那做回收、连接效果最好。相反，若有弥散、拖尾、不清楚、一团亮等情况就是切的不好，做后续实验成功率会降低。若效果很差建议改进体系重新切。
5，回收。用柱式试剂盒回收。回收后要测DNA浓度，还要电泳，为了看回收DNA的质量。若条带有弥散，即自目的条带以下有拖痕，不是清晰利落的一条带，则质量不好。因为条带拖痕表示它已碎裂成比它小的各种长度的片段，而主带虽然还在那个位置但也已遭到一定程度的破坏。质量不好的回收产物做连接成功率会降低，假阳性克隆会增加。造成回收质量差的原因可能是回收这步，也可能是酶切那步，如果酶切那步出现酶切④所描述的情况，就容易造成回收质量不好。只有回收到清晰、利索的条带，才不影响连接。
6，感受态。做连接要求感受态的效率要高。感受态的感受效率一般刚制备完时是最高的，以后逐渐减弱，而且每次开－80℃冰箱温度微升对感受态效率都有一定影响，久而久之效率就不行了，这就要求大家取感受态时动作迅速、最大程度减少感受态盒升温。都知道感受态效率高好，但麻烦的是感受态效率的高低不好通过实验来检测，因为若通过转质粒来检测，只要是效率中等的感受态都能长出很多克隆。所以如果你们的感受态已经储存了很长时间或者连接长的克隆连续几把都太少就要用新感受态了。感受态可以购买，也可以制备。制备感受态不推荐新手直接去做，最好由经验丰富者做或他带你做。用新做的感受态转质粒，用同样手法用量，你会发现比旧感受态明显多长很多克隆。
7，连接。最后才轮到连接。连接的问题讨论的是比较多的。如果前述若干步骤所得产物质量好，连接不会很难。
①DNA的量：DNA总量有几十ng就能连接成。当然如果你的DNA质量好，DNA用量越大连接效率越高。就怕你为了追求DNA数量而降低了质量，那可就得不偿失了。
②vector和insert的比例：配比的好就相当于增加两条核酸链末端碰撞的机会。如果insert不长（2kb以下）、vector是insert的几倍长，可以用1：3－1：9。如果insert较长（3、4kb以上）、vector和insert长度相似或insert比vector还长，可以用1：1－1：3。短片段的连接相对容易，做的好可以挑到好多正确的克隆。长片段的连接效率稍低。怎么计算：
| Vector | Insert | |
| 长度kb | x | y |
| 浓度ng/ul | m | n |
| 单位体积摩尔比 | m/x | n/y |
| 上样摩尔比 | 1 | A |
| 上样体积比 | (undefinedx)/m | (undefinedy)/n |
③体系体积：通常用10-20ul。体系中尽量少含有EDTA，因为会抑制酶活。对于新手，为了提高连接成功率，在满足DNA配比的前提下尽量多地提高两种DNA总量，甚至整个体系都由DNA补齐。
④T4连接酶：酶这东西自然是越贵越好，一分钱一分货，而且连接酶控制着整个分子克隆过程的瓶颈——连接，强烈建议买好的。我用过Promega的，还好；BBI的凑合用。如果连长片段就加二倍的连接酶。
⑤连接时间：按说明书。普通连接酶过夜。
⑥连接温度：最适是16℃。可以用PCR仪设定，或将大量水加少量冰放在泡沫冰盒里调制，扣盖。特殊的参照说明书。
⑦转化：连接的转化不能像转质粒那么随便，要尽量小心，连接体系全都转化进去，减少损失。一般所用的感受态细菌的体积最少是连接体系的5倍。长片段的连接转化时摇菌2小时。
⑧对照：对照很关键，可以反映出很多重要的信息，不要懒，你的连接若是问题不少，就要乖乖的做对照。一般有如下几种对照方式：
⑴转化质粒对照。质粒要微量，如1ng或更少。和连接产物同样抗性、一起转化、涂在同一个板上。这个对照目的是检测转化系统是否有效，即抗生素是否有效、板子是否有效、转化的手法是否正确、以及感受态的效率如何（这需要你每次转化质粒都用相同的手法、用量，看长的菌落数，若明显太少就要怀疑感受态）。还有一个作用，如果质粒早就长出来了，都长挺大了你的连接产物还没动静呢，那八成是没戏了，别等了赶快去准备下次连接的材料吧。
⑵切完回收的vector直接转化对照。如果你是双酶切，切完的vector和没切的vector的长度相差不大，或跑电泳这两种跑不很开，就要做这个对照。目的是看切的是否彻底，是否还有环状质粒存在。长不出克隆是对的，若长出克隆，好好改进你的酶切体系吧。
⑶切完回收的vector加连接酶自身连接再转化做对照。双酶切的，最好要做这个对照，而且这个对照长的克隆要挑若干提质粒。一、若切完的目的vector和没切的vector的长度相差较大，电泳条带离的远，这个对照能检测酶切和回收的质量。如果DNA末端遭破坏或断裂，会随机产生各种末端，这些末端少数能连接到一起，长度上小于等于回收的vector。二、若切完的vector和没切的vector的长度相差不大，这个对照除了检测“一”中所说的还检测是否有只进行了单酶切的。总之不长克隆或只长很少是对的，长多了还是去改进上游的步骤吧。
8，连接产物鉴定
①酶切谱。想迅速地知道结果的和测序不出来的时候做。有几种：连接所用的酶双酶切、backbone上的某一切点（insert中没有）单酶切（目的是看全长对不对）、backbone上和insert上各一个切点的酶单切（切出两条带，进一步鉴定insert的正确性，或TA克隆的方向）。注意，一定要将切后的产物和未切的质粒一起跑电泳，此举是为了证明是否进行了切割。
②测序。凡是要进行后续克隆、表达的连接质粒一定要测序。操作区要通测：即测序反应要覆盖所有的insert长度（一般一个测序反应的有效长度是700-800bp），和连接所用的酶切位点之外的序列（为了鉴定这个位点的完整性、以及外部原件如Cozak序列、终止密码子的完整性）。
如果上面的各步都注意到了而且做的很好，那成功率会较高，但也不能保证一次成功。在确保各步骤产物质量都不错的前提下若重复2-3次还没连上就要回头仔细检查这个克隆的策略有没有问题了。
总结起来有三点：一是设计准确，设计和策略是一切的前提；二是别偷懒，多做准备工作和对照；三是要量化，从酶切、回收到配比。做一个粗略的比喻，每做到一个细节，可能对连接成功率的提升只有5%，但是若做到8-10个细节，对成功率的提升是40-50%。
最后祝愿大家都能顺利完成连接反应！
