【共享】改良热硼酸盐法提取RNA
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(1)取3 g样品,加入10% 样品重的多聚聚乙烯吡咯烷酮(PVPP),用液氮研磨成细粉状,将细粉分为每份约3 g,并贮藏于-80℃下。
(2)在5O ml falcon管中加入2O ml提取缓冲液。提取液的组成为0.2 mol/L 脱水四硼酸钠(sodium tetriborate decahydrate)、30 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)、1% (W/V)十二烷基硫酸钠(SDS)、1%脱氧胆酸钠盐。再加入0.0309 g二硫苏糖(DTT)、200 ul乙基苯基聚乙二醇(NP-40)和0.4 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40),并置于80℃下平衡15 min。取出于-80℃中保存样品,加入热平衡后的提取缓冲液,振荡混匀。再加入800 ul蛋白酶K(20 mg/ml ),盖好管盖,平放于转速为120 r/min 、温度为42℃摇床上,摇动提取1.5 h。
(3)之后,向样品管中加人1.6 ml 2 mol/LKCl,振荡混匀,将样品管置于4℃条件下1~1.5h。将提取液转移至玻璃离心管中,在4℃条件下以12 000×g离心20 min。取上清液置于新的玻璃离心管中,加入1/4(或1/3)体积8 mol/L LiCl(~20℃),振荡混匀,于4℃放置过夜。4cc下以12 000×g离心20 min,去除上清液,RNA沉淀滞留于管底。加入3~5 ml冷的2 mol/L (4℃)LiCl,轻缓振荡,4℃下以12 000×g离心10 min,去除上清液。重复2 mol/L LiCl清洗2~3次,直到上清中无色素类物质。
(4)用2 ml 10 mmol/L。Tris-HCl(pH 7.5)充分溶解沉淀,4℃下以12 000×g离心10 min,去除不溶性的沉淀,将上清液转移至15 ml玻璃离心管中,加入200 ul(1/10体积)的2 mol/L 醋酸钾(pH 5.5)。于4℃温浴中放30 min。4℃下以12 000×g离心10 min。将上清液转移至新的玻璃离心管中,加入2.5倍体积的100% 乙醇,摇匀并置于-80℃条件下沉降RNA 1~2 h。
(5)4℃下9 800×g离心30 min,去除上清液,RNA沉淀滞留于管底。用1~2 ml 70%冷乙醇(-20℃)清洗沉淀,4℃下9 800×g离心5 min,去除上清液。室温下干燥RNA沉淀(20~30 min)至管内无水珠。
(6)用200 ul经过焦碳酸二乙醇(DEPC)处理的超纯水充分溶解沉淀。溶解液完全转移至1.5ml离心管中,再用100 ul经过DEPC处理的超纯水清洗原管壁和管底,将清洗液合并于RNA溶解沉淀中,加入1/10体积3 mol/L 醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积的100% 冷乙醇,混匀后放置于-20℃沉降RNA 1 h。混合液在4℃下以16 000×g离心30 min,去除上清液,用1~2 ml 70% 冷乙醇(-20℃)清洗管底滞留的RNA沉淀,4℃下以9 800×g离心5 min,去除上清液,RNA沉淀滞留管底。
(7)RNA沉淀于室温下干燥20~30 min。用适量经过EDPC处理的超纯水(100~300 ul)溶解RNA沉淀,RNA液置于-80℃条件下可长期保存,或用于分析。
(2)在5O ml falcon管中加入2O ml提取缓冲液。提取液的组成为0.2 mol/L 脱水四硼酸钠(sodium tetriborate decahydrate)、30 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)、1% (W/V)十二烷基硫酸钠(SDS)、1%脱氧胆酸钠盐。再加入0.0309 g二硫苏糖(DTT)、200 ul乙基苯基聚乙二醇(NP-40)和0.4 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40),并置于80℃下平衡15 min。取出于-80℃中保存样品,加入热平衡后的提取缓冲液,振荡混匀。再加入800 ul蛋白酶K(20 mg/ml ),盖好管盖,平放于转速为120 r/min 、温度为42℃摇床上,摇动提取1.5 h。
(3)之后,向样品管中加人1.6 ml 2 mol/LKCl,振荡混匀,将样品管置于4℃条件下1~1.5h。将提取液转移至玻璃离心管中,在4℃条件下以12 000×g离心20 min。取上清液置于新的玻璃离心管中,加入1/4(或1/3)体积8 mol/L LiCl(~20℃),振荡混匀,于4℃放置过夜。4cc下以12 000×g离心20 min,去除上清液,RNA沉淀滞留于管底。加入3~5 ml冷的2 mol/L (4℃)LiCl,轻缓振荡,4℃下以12 000×g离心10 min,去除上清液。重复2 mol/L LiCl清洗2~3次,直到上清中无色素类物质。
(4)用2 ml 10 mmol/L。Tris-HCl(pH 7.5)充分溶解沉淀,4℃下以12 000×g离心10 min,去除不溶性的沉淀,将上清液转移至15 ml玻璃离心管中,加入200 ul(1/10体积)的2 mol/L 醋酸钾(pH 5.5)。于4℃温浴中放30 min。4℃下以12 000×g离心10 min。将上清液转移至新的玻璃离心管中,加入2.5倍体积的100% 乙醇,摇匀并置于-80℃条件下沉降RNA 1~2 h。
(5)4℃下9 800×g离心30 min,去除上清液,RNA沉淀滞留于管底。用1~2 ml 70%冷乙醇(-20℃)清洗沉淀,4℃下9 800×g离心5 min,去除上清液。室温下干燥RNA沉淀(20~30 min)至管内无水珠。
(6)用200 ul经过焦碳酸二乙醇(DEPC)处理的超纯水充分溶解沉淀。溶解液完全转移至1.5ml离心管中,再用100 ul经过DEPC处理的超纯水清洗原管壁和管底,将清洗液合并于RNA溶解沉淀中,加入1/10体积3 mol/L 醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积的100% 冷乙醇,混匀后放置于-20℃沉降RNA 1 h。混合液在4℃下以16 000×g离心30 min,去除上清液,用1~2 ml 70% 冷乙醇(-20℃)清洗管底滞留的RNA沉淀,4℃下以9 800×g离心5 min,去除上清液,RNA沉淀滞留管底。
(7)RNA沉淀于室温下干燥20~30 min。用适量经过EDPC处理的超纯水(100~300 ul)溶解RNA沉淀,RNA液置于-80℃条件下可长期保存,或用于分析。