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【共享】操作RNA的注意事项整理

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一、RNA抽提注意事项
~undefined 尽可能无RNA酶的环境下操作,最好有专门场所
~undefined 耗材的处理:
电泳槽需0.5 M NaOH处理过夜后DEPC水清洗
试管氯仿浸泡处理后DEPC水清洗
枪头和eppendorf管DEPC水浸泡后灭菌处理
~undefined 实验者本身防护:一次性手套,口罩等
~undefined 启盖前震荡离心管有助于防止气溶胶形成
~undefined 正确的操作方式
二、RNA操作常见问题分析 
问题       可能原因          解决方法
产量太低      样本裂解或匀浆不充分     延长匀浆时间
      RNA沉淀溶解不充分        65℃加热可促进溶解
A260/A280<1.65  匀浆时,样本太多,抽提液小 增加RNA抽提试剂用量
    匀浆后,样本没有静置    室温静置5分钟,促进裂解反应
    水相中可能有酚残留    吸取上清时应注意操作的正确性
    RNA沉淀溶解不充分     加热可促进溶解
 测比值时,RNA溶解在DEPC水中,低的离子浓度和PH值增加了280nm的吸光值        比值时,采用TE溶液溶解RNA
RNA降解    取样操作不正确    取样后应立即抽提和冻存
     样本保存不当    -80℃或液氮保存
    液相中可能有RNA酶污染    采用RNA抑制剂
   制胶时所用甲醛的PH值小于3.5  试剂新鲜配制
DNA污染  匀浆时,样本太多,而抽提液使用量太小  增加抽提液用量
蛋白、多糖污染  抽提时蛋白和多糖去除不彻底  RNA沉淀时,加入部分盐溶液,选择性沉淀RNA
三、确定RNA质量的常用方法
1) 检测RNA溶液的吸光度
280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景(溶液浑浊度)、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的,我们只看OD260/OD280(Ratio,R)。当R>1.82时,说明RNA中蛋白或者其他有机物的污染是可以容忍的,不过要注意,当用Tris作为缓冲液检测吸光度时,R值可能会大于2(一般应该是<2.2的)。当R<1.8时,溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显,你可以根据自己的需要决定要不要使用这份RNA(不同的实验对RNA质量的要求不同)。当R>2.2时,说明RNA已经水解成单核酸了。
2) RNA的电泳图谱
一般的,RNA的电泳都是用变性胶进行的。但如果仅仅是为了检测RNA的质量,没有必要进行如此麻烦的实验,用普通的琼脂糖胶就可以了。电泳的目的在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值,或者是mRNA smear的完整性。一般的,如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利(指条带的边缘清晰),并且28S的亮度在18S条带的两倍以上,我们认为RNA的质量是好。
3) 保温试验:确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。
按照样品浓度,从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,用pH7.0的Tris缓冲液补充到10μl的总体积,然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。
时间到了之后,取出两份样本进行电泳。电泳完成后,比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别(当然,它们的条带也要符合方法2中的条件),则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染,RNA的质量很好。相反的,如果70℃保温的样本有明显的降解,则说明RNA溶液中有RNA酶污染。
四、RNA酶活性的控制
为了获得高质量的真核细胞mRNA, 必须使用RNA酶抑制剂或采用破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法,最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的RNA酶的活性。同时,避免偶然引入实验室内其他潜在的痕量RNA酶也很重要。
实验过程中,由于操作不慎,外源性RNA酶可以通过下述途径污染RNA:
(1)玻璃制品、塑料制品和电泳槽: 灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNA酶,可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA。实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶法染,使用前必须于180 ℃干烤8小时或更长时间(玻璃器皿)或用氯仿冲洗(塑料制品)。另一种方法是用0.1 %焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯,试管和其他用品。DEPC是RNA酶的强烈抑制剂,但其作用并不是绝对的(Fedorcsak和Ehrenberg,1966)。灌满DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置2小时,然后用灭菌水淋洗数次, 并于100℃干烤15分钟(Kumar和Lindberg,1972)。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸气灭菌15分钟。上述处理可以除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。
用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净,再用水冲洗,用乙醇干燥,然后灌满3%的H2O2溶液,于室温放置10分钟,然后用0.1 %DEPC处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记,存放在指定地点,为RNA实验专用。
(2)研究人员造成的污染: RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此,在准备分离的和分析RNA的材料和溶液时,主有涉及RNA的一切操作过程中,都应戴一次性手套,接触"胖的"玻璃器皿和其他物品以后,手套就可能沾染上RNA酶,因此进行RNA实验时应勤换手套。尽量不要对着RNA样品呼气或说话,以防RNA酶污染。
(3)污染的溶液: 用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液,用干烤过的药匙称取试剂,将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话溶液均应用0.1%DEPC于37℃至少处理12小时,然后于100℃加热15分钟或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高压下蒸气灭菌15分钟。
注:DEPC可与胺类迅速发生化学反应,因些不能用来处理含有Tris 一类的缓冲液。可存几瓶新的未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。
RNA酶的抑制剂:
(1)RNA酶的蛋白质抑制剂:该抑制剂是从人胎盘分离的一种蛋白质,可与多种RNA酶紧密结合形成非共价结合的等摩尔复合物,使RNA酶失活。该蛋白质应置于含5mmol/L二硫苏糖醇(DTT)的50%甘油中,贮存于-20℃。抑制剂制品冻融数次后或放置在氧化条件下即应弃之不用,因为上述处理会使蛋白质变性从而释放出所结合的RNA酶。因此,在使用变性剂裂解哺乳动物细胞提取RNA的初始步聚中不应使用这种蛋白抑制剂。然而采用更温和的裂解方法时应使用这种抑制剂,并且在后续的所有RNA纯化步骤中均应有此蛋白质存在。由于酚抽提可以除蛋白质抑制剂,故应在纯化过程中补加几次抑制剂。其最大活性的发挥要求巯基试剂,而且它并不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。
(2)氧钒核糖核苷复合物:这种由氧钒(1V)离子和4种核糖核苷之中的任意一种所形成的复合物,是种过渡态类似物,它能与多种RNA酶结合并几乎能百分之百地抑制RNA酶的活性。这4种氧钒核糖核苷复合物可加入完整细胞中,在RNA提取和纯化的所有过程中,其使用浓度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母细胞中进行翻译, 并能作为某些酶促反应(如mRNA反转录)的模板。然而氧钒核糖核苷复合物强烈抑制mRNA在无细胞体系中的翻译,因此必须用含0.1 %羟基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/L Tris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以除之。
(3)Macaloid(硅藻上):Macaloid是一种粘土,很多年前就发现它能吸附RNA酶,用缓冲液将其制成浆液,以0.015%(W/V)的终浓度溶解细胞。 这种粘土随同它所吸附的RNA酶可在后续的RNA纯化过程中(如酚抽提后)经离心去除。
破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法:
  用强烈变性如盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质,导致细胞结构破碎,核蛋白由于其二级结构的破坏而从核酸上解离下来。RNA酶可耐受多种处理等,因此可联用上述试剂,从组织中,如富含RNA酶的胰腺中,提取完整无损的RNA。

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