【求助】急:外源蛋白与宿主细胞膜发生黏附,求检测方法
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课题研究外源分泌蛋白与宿主细胞的相互作用,现有一分泌蛋白能粘附于Hela细胞膜,引起后续一系列反应,但作用位点未知,且该蛋白作用于细胞膜,但未被吞噬进胞内,求怎样检测该蛋白粘附于膜的量
定性可以用免疫荧光,定量也可以大概的用免疫荧光看看。
定性用免疫荧光做,具体方法:
1、做Hela细胞的细胞爬片
2、用5%BSA的PBS溶液去封闭,
3、用你的外源分泌蛋白与之结合(外源分泌蛋白溶于PBS中,具体浓度待摸索)
4、然后PBS漂洗3次,再用你的外源分泌蛋白的荧光抗体去结合(溶于5%BSA的PBS溶液中)
5、PBS漂洗3次,荧光显微镜观察结果,看荧光是否在膜上。
本人做的是用自己表达的蛋白,所以上面有undefinedhis标记,所以用的是抗-HIS的一抗,然后用的荧光二抗。
本实验中的细胞是否用多聚甲醛固定要自己做实验试试,我那时两种方法都做了,没有区别。
定量检测的话可以使用流式检测,具体可见我的附件给出的例子(横轴当时标记的是绿色荧光,故偷懒使用了Annexin V的原来标记而未改成FITC),若你要得到每个细胞上结合了多少ug的你的目标蛋白的话,可能比较难。
1、做Hela细胞的细胞爬片
2、用5%BSA的PBS溶液去封闭,
3、用你的外源分泌蛋白与之结合(外源分泌蛋白溶于PBS中,具体浓度待摸索)
4、然后PBS漂洗3次,再用你的外源分泌蛋白的荧光抗体去结合(溶于5%BSA的PBS溶液中)
5、PBS漂洗3次,荧光显微镜观察结果,看荧光是否在膜上。
本人做的是用自己表达的蛋白,所以上面有undefinedhis标记,所以用的是抗-HIS的一抗,然后用的荧光二抗。
本实验中的细胞是否用多聚甲醛固定要自己做实验试试,我那时两种方法都做了,没有区别。
定量检测的话可以使用流式检测,具体可见我的附件给出的例子(横轴当时标记的是绿色荧光,故偷懒使用了Annexin V的原来标记而未改成FITC),若你要得到每个细胞上结合了多少ug的你的目标蛋白的话,可能比较难。
多谢两位回复 参考做做试试
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