【求助】A与B结合抑制了B与C的结合能说竞争性抑制吗
丁香园论坛
1650
如题，A B C是3个蛋白，目前见到到A结合B使B-C复合物减少，我的问题是这样我能说A与B的结合竞争性抑制了B与C的结合吗？因为A结合B还有可能使B发生了变构从而影响了其与C的结合，在写论文的时候这个“竞争性"抑制的词是不是准确呀？
joo wrote:
如题，A B C是3个蛋白，目前见到到A结合B使B-C复合物减少，我的问题是这样我能说A与B的结合竞争性抑制了B与C的结合吗？因为A结合B还有可能使B发生了变构从而影响了其与C的结合，在写论文的时候这个“竞争性"抑制的词是不是准确呀？
我个人感觉你这个实验应该蛮有意义，但是在你下结论前我想有几个问题是必须要先解释清楚的。
1，是不是竞争性抑制，我持保留态度，因为你未能提供太多的描述，但至少它肯可能是竞争关系。在我看来，如果存在抑制关系，最普遍的现象是，首先A-B复合物增多了，同时b-c复合物减少了，同时，游离的单体的量也有变化，即a单体理论上应该减少而C单体理论上增多。如果你是做体内实验，A-B复合物增多，b-c减少的调控变化可能会导致生理或者表型上的变化，或者整个基因表达调控网络的变化；上述我说的是普遍现象，据我了解，有的时候并不符合这样的最普遍现象，有的时候A单体增多，导致b单体的表达量同时增多，这样的结果是，a-b复合体增多，但是不见得b-c复合体就减少。这个现象在做体外实验的时候很难遇得到，从体内直接提取蛋白有可能会遇到。
2， 你的这种结合时特异的还是非特异的？我说的非特异，并不是说a-b结合时假阳性，是说a是仅仅针对于b-c有这样的作用，还是普遍性具有竞争作用？我个人意见觉得，竞争性抑制在一定条件下应该像上述1中描述，一种底物浓度的梯度变化，会在一定范围能造成其它底物、复合体的梯度变化。而普遍性抑制我觉的不存在这个关系，从你的描述中我还可以有另一种推测，即，a只是广泛性地“屏蔽”B与c的结合，这种关系我觉得更像是抑制，跟竞争没有关系。
3， 你说有可能啊会引起b构想变化而导致b-c复合体减少，这是你的推测呢还是基于实验证据？如果这种构想变化存在，我觉得这也应该算是竞争性抑制的一种吧，因为竞争性抑制是一种普遍的描述，并不管是怎么样竞争的。但是如果你要说清楚这样一点，需要实验证据来支持。
以上拙见，供参考
不构成严格意义上的竞争性抑制。只能讲A 抑制了 B与C之间的相互作用，但A不一定是通过与B的相互作用从而抑制B与C之间的相互作用，不排除A的表达导致了蛋白X与B发生相互作用或者增强了X与B的相互作用 (机制可能是A导致X的表达量或构象或定位或修饰程度等发生变化），这种相互作用不依赖于A和B的相互作用，但竞争性抑制了B与C的相互作用。如果你想排除这种可能，可以但不是唯一可以做的是确定A与B是否存在in vitro直接相互作用以及找到A与B相互作用的位点，突变之，重复上述in vivo实验。
bigbang_0_0 wrote:
不构成严格意义上的竞争性抑制。只能讲A 抑制了 B与C之间的相互作用，但A不一定是通过与B的相互作用从而抑制B与C之间的相互作用，不排除A的表达导致了蛋白X与B发生相互作用或者增强了X与B的相互作用 (机制可能是A导致X的表达量或构象或定位或修饰程度等发生变化），这种相互作用不依赖于A和B的相互作用，但竞争性抑制了B与C的相互作用。如果你想排除这种可能，可以但不是唯一可以做的是确定A与B是否存在in vitro直接相互作用以及找到A与B相互作用的位点，突变之，重复上述in vivo实验。
lz都说了是A和B相互结合的嘛。当然你说的有道理。
westernblotx wrote:
lz都说了是A和B相互结合的嘛。当然你说的有道理。
我没说A和B不相互作用，只是说B与C相互作用强度的变化依赖于A的存在但不依赖于A与B的相互作用；再说A和B的互作是直接的还是间接的，楼主也没有给出相关证据。
您的回答也很有道理，小辈学习了！
首先多谢westernblotx与bigbang_0_0两位战友！二位的高见我在慢慢消化吸收，而且对我未来的实验有很好的提议！再次多谢！
我的问题说起来稍微有点复杂！前期试验已经证实，A与B在体外及细胞内结合，A过表达能够抑制作为蛋白激酶的B的激酶活性，同时我们检测到了A过表达在蛋白水平抑制了B与C的表达（B的下降幅度远大于C），B是一种目前研究得比较透彻的细胞周期依赖性蛋白激酶CDK，而C呢也是公认的与B结合的cyclin。目前我们已经初步得到了A降低B与C表达水平的原因是通过A抑制B与C表达的上游基因导致的，但是作为B这样的CDK，A与之结合是一定要对其产生一些什么作用的。于是我们研究了A对B的降解，磷酸化调节等过程的影响，结果证实A对上述调节B活性的关键步骤都没有影响。同时我们检测到了A过表达使同样作为B活化关键步骤的B-C复合物的形成减少了，在这步实验中我们是通过免疫沉淀相同B蛋白含量的细胞裂解液，然后来检测复合物中C的含量来确定的。
目前的实验的确是没有能够证明A与B的结合是直接的还是间接地，这也是我们未来要进行的。但是我们同时在试验中检测到了A过表达同时也能使B与目前已经公认的另外一个能够与B结合的cyclin分子D的结合也减少了！由于目前文献已经表明，CDK是通过PSTAIRE helix结合cyclin分子的cyclin box的，由此我们推测，A结合B可能导致了A结合了PSTAIRE helix，或者导致PSTAIRE helix变构使C与D不能再结合B了！
还请二位战友及更多的战友赐教！
我的问题说起来稍微有点复杂！前期试验已经证实，A与B在体外及细胞内结合，A过表达能够抑制作为蛋白激酶的B的激酶活性，同时我们检测到了A过表达在蛋白水平抑制了B与C的表达（B的下降幅度远大于C），B是一种目前研究得比较透彻的细胞周期依赖性蛋白激酶CDK，而C呢也是公认的与B结合的cyclin。目前我们已经初步得到了A降低B与C表达水平的原因是通过A抑制B与C表达的上游基因导致的，但是作为B这样的CDK，A与之结合是一定要对其产生一些什么作用的。于是我们研究了A对B的降解，磷酸化调节等过程的影响，结果证实A对上述调节B活性的关键步骤都没有影响。同时我们检测到了A过表达使同样作为B活化关键步骤的B-C复合物的形成减少了，在这步实验中我们是通过免疫沉淀相同B蛋白含量的细胞裂解液，然后来检测复合物中C的含量来确定的。
目前的实验的确是没有能够证明A与B的结合是直接的还是间接地，这也是我们未来要进行的。但是我们同时在试验中检测到了A过表达同时也能使B与目前已经公认的另外一个能够与B结合的cyclin分子D的结合也减少了！由于目前文献已经表明，CDK是通过PSTAIRE helix结合cyclin分子的cyclin box的，由此我们推测，A结合B可能导致了A结合了PSTAIRE helix，或者导致PSTAIRE helix变构使C与D不能再结合B了！
还请二位战友及更多的战友赐教！
自己顶顶！
有一个问题不明，请指教： 既然a是通过调控b与c的上游调控基因来调控后二者的表达水平的，那他是仅通过上游调控基因来调节b。c呢还是既结合上游调控元件有调控b。c？因为你说了有可能与b直接结合也可能是间接结合，这个问题的回答也许可以有助于你明白他们的结合关系。
基于你的描述，“CDK是通过PSTAIRE helix结合cyclin分子的cyclin box的，由此我们推测，A结合B可能导致了A结合了PSTAIRE helix，或者导致PSTAIRE helix变构使C与D不能再结合B了”，是不是变构不好说，因为我个人认为变构绝不仅仅是helix的变构，整体结构的变化或者主要功能区域的变化才叫变构，除非你有这样的实验证据，还难说是变构有。a、b、c间的结合，到底是怎么样，我认为你可以通过突变helix来看他们的结合关系。如果是竞争性关系，c的helix突变，a与c的结合减少，是不是会导致a与b的结合量又有所回复？从你的描述来看，好像不像你最初描述的a-b结合导致b-c减少，而是a-c结合到这ab减少一样，如最后一句话“CDK是通过PSTAIRE helix结合cyclin分子的cyclin box的，由此我们推测，A结合B可能导致了A结合了PSTAIRE helix，或者导致PSTAIRE helix变构使C与D不能再结合B了！“
基于你的描述，“CDK是通过PSTAIRE helix结合cyclin分子的cyclin box的，由此我们推测，A结合B可能导致了A结合了PSTAIRE helix，或者导致PSTAIRE helix变构使C与D不能再结合B了”，是不是变构不好说，因为我个人认为变构绝不仅仅是helix的变构，整体结构的变化或者主要功能区域的变化才叫变构，除非你有这样的实验证据，还难说是变构有。a、b、c间的结合，到底是怎么样，我认为你可以通过突变helix来看他们的结合关系。如果是竞争性关系，c的helix突变，a与c的结合减少，是不是会导致a与b的结合量又有所回复？从你的描述来看，好像不像你最初描述的a-b结合导致b-c减少，而是a-c结合到这ab减少一样，如最后一句话“CDK是通过PSTAIRE helix结合cyclin分子的cyclin box的，由此我们推测，A结合B可能导致了A结合了PSTAIRE helix，或者导致PSTAIRE helix变构使C与D不能再结合B了！“
首先，目前的结果看，A是通过影响调控B C 上游的基因影响了二者的表达，因为细胞周期本身的进展就是级链反应，上游抑制后不能进入特定的时相，因此导致了细胞周期部分相应时相表型发生了变化。这个目前看和是否直接结合没有关系。
至于是否变构，这个问题是这样的。考虑到变构当然是一种猜想。这个猜想基于A结合B后，导致B-C，B-D复合物的减少。如果单纯是B-C的减少那可能有其他的原因，但由于C与D都是cyclin分子，他们都去结合B的PSTAIRE helix,由此我们产生了这样的猜测，会不会是A结合B，占据了B结合C D的结合位点（PSTAIRE helix），当然这需要证明A与B的结合是直接结合 ；还有一种可能就是A结合B，B产生了变构，使C D不能结合B了！后者是否直接结合我觉得就不是那么举足轻重了！
请赐教！
至于是否变构，这个问题是这样的。考虑到变构当然是一种猜想。这个猜想基于A结合B后，导致B-C，B-D复合物的减少。如果单纯是B-C的减少那可能有其他的原因，但由于C与D都是cyclin分子，他们都去结合B的PSTAIRE helix,由此我们产生了这样的猜测，会不会是A结合B，占据了B结合C D的结合位点（PSTAIRE helix），当然这需要证明A与B的结合是直接结合 ；还有一种可能就是A结合B，B产生了变构，使C D不能结合B了！后者是否直接结合我觉得就不是那么举足轻重了！
请赐教！
joo wrote:
首先，目前的结果看，A是通过影响调控B C 上游的基因影响了二者的表达，因为细胞周期本身的进展就是级链反应，上游抑制后不能进入特定的时相，因此导致了细胞周期部分相应时相表型发生了变化。这个目前看和是否直接结合没有关系。
至于是否变构，这个问题是这样的。考虑到变构当然是一种猜想。这个猜想基于A结合B后，导致B-C，B-D复合物的减少。如果单纯是B-C的减少那可能有其他的原因，但由于C与D都是cyclin分子，他们都去结合B的PSTAIRE helix,由此我们产生了这样的猜测，会不会是A结合B，占据了B结合C D的结合位点（PSTAIRE helix），当然这需要证明A与B的结合是直接结合 ；还有一种可能就是A结合B，B产生了变构，使C D不能结合B了！后者是否直接结合我觉得就不是那么举足轻重了！
请赐教！
既然这样，也不用先去管是不是直接结合了，或是不是变构，先把B的helix做突变实验看看。
多谢westernblotx战友! 的确应该把B的helix突变了是最能说能说明目前的困惑的。如果突变后A与B的结合下降,那么能说明A结合了B的PSTAIRE区域,若否的话,是不是就该考虑变构的问题了呢？没有什么更多的思路!
westernblotx战友，想问一下就目前的情况你可以成为是竞争性抑制吗？
westernblotx战友，想问一下就目前的情况你可以成为是竞争性抑制吗？
就算突变以后a与b的结合减弱，也还不能说是直接或者间接结合，因为缺乏实验证据，想一个很经典的例子，DNA复制、转录结合因子，很多时候我们看到的是某一个因子A和DNA直接结合，但是实际上是该因子和其他蛋白B形成复合体，而B才是真正负责结合的因子，但真正执行功能的是A，这样造成的假象很可能就是A直接与DNA结合。我举这个例子不一定合适你的具体情况，但是我的意思是现在说明他是间接还是直接结合还缺乏证据。至于变构的问题，我先前也有提到过，你不是不可以在文章中提，但是这个只是作为一种假设，因为变构的问题，根据我有限的知识，直接的证据来自于结构分析——如果尚未有这样的结构分析报道护着实验证据，你只能做出猜测。
关于是不是竞争抑制，我还是不能肯定。我只能觉得他是抑制关系，至于竞争性，我觉得需要谨慎。理由前述
关于是不是竞争抑制，我还是不能肯定。我只能觉得他是抑制关系，至于竞争性，我觉得需要谨慎。理由前述
结合位点是什么？
能否用物理作用逆转（例如透析）？
结合的动力学？
能否用物理作用逆转（例如透析）？
结合的动力学？
dnazyme wrote:
结合位点是什么？
能否用物理作用逆转（例如透析）？
结合的动力学？
专业人士来了~~~~~~
结合位点正在做。原来是因为A的同源蛋白E与B结合，且别人做了E与B的结合位点，于是我们也从确定A去结合B的结合区域来进行结合位点的鉴定。由于A目前关于文献报道非常少，所以只能逐渐的缩小结合区域，目前确定了A上的7个氨基酸区域结合B，而且这7个氨基酸区域与E结合B的同源区域时不同的。想到做B结合A的区域，也是最近焦点集中到了PSTAIRE helix才觉得迫切起来的!
多谢westernblotx战友,的确目前没有证明是否直接结合是不够尽善尽美的,有机会在进一步实验的时候会考虑补上这块的!
请教一下dnazyme战友, 物理作用逆转都有哪些方法是简单易行的主流方法,这方面没有接触过,回头看看考虑一下是不是有条件开展! 还有结合动力学的问题,一窍不通!还请多多赐教!
还有不知道通过建立蛋白质三维构象能够预测二者的结合区域呢？
恳请大家赐教!
多谢westernblotx战友,的确目前没有证明是否直接结合是不够尽善尽美的,有机会在进一步实验的时候会考虑补上这块的!
请教一下dnazyme战友, 物理作用逆转都有哪些方法是简单易行的主流方法,这方面没有接触过,回头看看考虑一下是不是有条件开展! 还有结合动力学的问题,一窍不通!还请多多赐教!
还有不知道通过建立蛋白质三维构象能够预测二者的结合区域呢？
恳请大家赐教!
既然你已经做了“前期试验已经证实，A与B在体外及细胞内结合，A过表达能够抑制作为蛋白激酶的B的激酶活性”
那这个CDK的体外酶活性抑制实验中，怎么没有考虑做一下抑制动力学呢？
要说明它是不是竞争性抑制剂，就要从体外酶学的动力学实验下手。
至于抑制机理和结合位点的研究，结晶或共结晶可能是最直接的方法。
那这个CDK的体外酶活性抑制实验中，怎么没有考虑做一下抑制动力学呢？
要说明它是不是竞争性抑制剂，就要从体外酶学的动力学实验下手。
至于抑制机理和结合位点的研究，结晶或共结晶可能是最直接的方法。
刚刚出差回来，看到了阳光海岛战友提出的建议！谢谢楼上所有战友的意见和建议，学到了好多东西！
本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴
师兄微信号：shixiongcoming
