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【求助】A与B结合抑制了B与C的结合能说竞争性抑制吗

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如题,A B C是3个蛋白,目前见到到A结合B使B-C复合物减少,我的问题是这样我能说A与B的结合竞争性抑制了B与C的结合吗?因为A结合B还有可能使B发生了变构从而影响了其与C的结合,在写论文的时候这个“竞争性"抑制的词是不是准确呀?
joo wrote:
如题,A B C是3个蛋白,目前见到到A结合B使B-C复合物减少,我的问题是这样我能说A与B的结合竞争性抑制了B与C的结合吗?因为A结合B还有可能使B发生了变构从而影响了其与C的结合,在写论文的时候这个“竞争性"抑制的词是不是准确呀?

我个人感觉你这个实验应该蛮有意义,但是在你下结论前我想有几个问题是必须要先解释清楚的。

1,是不是竞争性抑制,我持保留态度,因为你未能提供太多的描述,但至少它肯可能是竞争关系。在我看来,如果存在抑制关系,最普遍的现象是,首先A-B复合物增多了,同时b-c复合物减少了,同时,游离的单体的量也有变化,即a单体理论上应该减少而C单体理论上增多。如果你是做体内实验,A-B复合物增多,b-c减少的调控变化可能会导致生理或者表型上的变化,或者整个基因表达调控网络的变化;上述我说的是普遍现象,据我了解,有的时候并不符合这样的最普遍现象,有的时候A单体增多,导致b单体的表达量同时增多,这样的结果是,a-b复合体增多,但是不见得b-c复合体就减少。这个现象在做体外实验的时候很难遇得到,从体内直接提取蛋白有可能会遇到。

2, 你的这种结合时特异的还是非特异的?我说的非特异,并不是说a-b结合时假阳性,是说a是仅仅针对于b-c有这样的作用,还是普遍性具有竞争作用?我个人意见觉得,竞争性抑制在一定条件下应该像上述1中描述,一种底物浓度的梯度变化,会在一定范围能造成其它底物、复合体的梯度变化。而普遍性抑制我觉的不存在这个关系,从你的描述中我还可以有另一种推测,即,a只是广泛性地“屏蔽”B与c的结合,这种关系我觉得更像是抑制,跟竞争没有关系。
3, 你说有可能啊会引起b构想变化而导致b-c复合体减少,这是你的推测呢还是基于实验证据?如果这种构想变化存在,我觉得这也应该算是竞争性抑制的一种吧,因为竞争性抑制是一种普遍的描述,并不管是怎么样竞争的。但是如果你要说清楚这样一点,需要实验证据来支持。

以上拙见,供参考
不构成严格意义上的竞争性抑制。只能讲A 抑制了 B与C之间的相互作用,但A不一定是通过与B的相互作用从而抑制B与C之间的相互作用,不排除A的表达导致了蛋白X与B发生相互作用或者增强了X与B的相互作用 (机制可能是A导致X的表达量或构象或定位或修饰程度等发生变化),这种相互作用不依赖于A和B的相互作用,但竞争性抑制了B与C的相互作用。如果你想排除这种可能,可以但不是唯一可以做的是确定A与B是否存在in vitro直接相互作用以及找到A与B相互作用的位点,突变之,重复上述in vivo实验。
bigbang_0_0 wrote:
不构成严格意义上的竞争性抑制。只能讲A 抑制了 B与C之间的相互作用,但A不一定是通过与B的相互作用从而抑制B与C之间的相互作用,不排除A的表达导致了蛋白X与B发生相互作用或者增强了X与B的相互作用 (机制可能是A导致X的表达量或构象或定位或修饰程度等发生变化),这种相互作用不依赖于A和B的相互作用,但竞争性抑制了B与C的相互作用。如果你想排除这种可能,可以但不是唯一可以做的是确定A与B是否存在in vitro直接相互作用以及找到A与B相互作用的位点,突变之,重复上述in vivo实验。

lz都说了是A和B相互结合的嘛。当然你说的有道理。
westernblotx wrote:
lz都说了是A和B相互结合的嘛。当然你说的有道理。


我没说A和B不相互作用,只是说B与C相互作用强度的变化依赖于A的存在但不依赖于A与B的相互作用;再说A和B的互作是直接的还是间接的,楼主也没有给出相关证据。

您的回答也很有道理,小辈学习了!
首先多谢westernblotx与bigbang_0_0两位战友!二位的高见我在慢慢消化吸收,而且对我未来的实验有很好的提议!再次多谢!

我的问题说起来稍微有点复杂!前期试验已经证实,A与B在体外及细胞内结合,A过表达能够抑制作为蛋白激酶的B的激酶活性,同时我们检测到了A过表达在蛋白水平抑制了B与C的表达(B的下降幅度远大于C),B是一种目前研究得比较透彻的细胞周期依赖性蛋白激酶CDK,而C呢也是公认的与B结合的cyclin。目前我们已经初步得到了A降低B与C表达水平的原因是通过A抑制B与C表达的上游基因导致的,但是作为B这样的CDK,A与之结合是一定要对其产生一些什么作用的。于是我们研究了A对B的降解,磷酸化调节等过程的影响,结果证实A对上述调节B活性的关键步骤都没有影响。同时我们检测到了A过表达使同样作为B活化关键步骤的B-C复合物的形成减少了,在这步实验中我们是通过免疫沉淀相同B蛋白含量的细胞裂解液,然后来检测复合物中C的含量来确定的。

目前的实验的确是没有能够证明A与B的结合是直接的还是间接地,这也是我们未来要进行的。但是我们同时在试验中检测到了A过表达同时也能使B与目前已经公认的另外一个能够与B结合的cyclin分子D的结合也减少了!由于目前文献已经表明,CDK是通过PSTAIRE helix结合cyclin分子的cyclin box的,由此我们推测,A结合B可能导致了A结合了PSTAIRE helix,或者导致PSTAIRE helix变构使C与D不能再结合B了!

还请二位战友及更多的战友赐教!
自己顶顶!
有一个问题不明,请指教: 既然a是通过调控b与c的上游调控基因来调控后二者的表达水平的,那他是仅通过上游调控基因来调节b。c呢还是既结合上游调控元件有调控b。c?因为你说了有可能与b直接结合也可能是间接结合,这个问题的回答也许可以有助于你明白他们的结合关系。

基于你的描述,“CDK是通过PSTAIRE helix结合cyclin分子的cyclin box的,由此我们推测,A结合B可能导致了A结合了PSTAIRE helix,或者导致PSTAIRE helix变构使C与D不能再结合B了”,是不是变构不好说,因为我个人认为变构绝不仅仅是helix的变构,整体结构的变化或者主要功能区域的变化才叫变构,除非你有这样的实验证据,还难说是变构有。a、b、c间的结合,到底是怎么样,我认为你可以通过突变helix来看他们的结合关系。如果是竞争性关系,c的helix突变,a与c的结合减少,是不是会导致a与b的结合量又有所回复?从你的描述来看,好像不像你最初描述的a-b结合导致b-c减少,而是a-c结合到这ab减少一样,如最后一句话“CDK是通过PSTAIRE helix结合cyclin分子的cyclin box的,由此我们推测,A结合B可能导致了A结合了PSTAIRE helix,或者导致PSTAIRE helix变构使C与D不能再结合B了!“
首先,目前的结果看,A是通过影响调控B C 上游的基因影响了二者的表达,因为细胞周期本身的进展就是级链反应,上游抑制后不能进入特定的时相,因此导致了细胞周期部分相应时相表型发生了变化。这个目前看和是否直接结合没有关系。

至于是否变构,这个问题是这样的。考虑到变构当然是一种猜想。这个猜想基于A结合B后,导致B-C,B-D复合物的减少。如果单纯是B-C的减少那可能有其他的原因,但由于C与D都是cyclin分子,他们都去结合B的PSTAIRE helix,由此我们产生了这样的猜测,会不会是A结合B,占据了B结合C D的结合位点(PSTAIRE helix),当然这需要证明A与B的结合是直接结合 ;还有一种可能就是A结合B,B产生了变构,使C D不能结合B了!后者是否直接结合我觉得就不是那么举足轻重了!

请赐教!
joo wrote:
首先,目前的结果看,A是通过影响调控B C 上游的基因影响了二者的表达,因为细胞周期本身的进展就是级链反应,上游抑制后不能进入特定的时相,因此导致了细胞周期部分相应时相表型发生了变化。这个目前看和是否直接结合没有关系。

至于是否变构,这个问题是这样的。考虑到变构当然是一种猜想。这个猜想基于A结合B后,导致B-C,B-D复合物的减少。如果单纯是B-C的减少那可能有其他的原因,但由于C与D都是cyclin分子,他们都去结合B的PSTAIRE helix,由此我们产生了这样的猜测,会不会是A结合B,占据了B结合C D的结合位点(PSTAIRE helix),当然这需要证明A与B的结合是直接结合 ;还有一种可能就是A结合B,B产生了变构,使C D不能结合B了!后者是否直接结合我觉得就不是那么举足轻重了!

请赐教!


既然这样,也不用先去管是不是直接结合了,或是不是变构,先把B的helix做突变实验看看。
多谢westernblotx战友! 的确应该把B的helix突变了是最能说能说明目前的困惑的。如果突变后A与B的结合下降,那么能说明A结合了B的PSTAIRE区域,若否的话,是不是就该考虑变构的问题了呢?没有什么更多的思路!

westernblotx战友,想问一下就目前的情况你可以成为是竞争性抑制吗?
就算突变以后a与b的结合减弱,也还不能说是直接或者间接结合,因为缺乏实验证据,想一个很经典的例子,DNA复制、转录结合因子,很多时候我们看到的是某一个因子A和DNA直接结合,但是实际上是该因子和其他蛋白B形成复合体,而B才是真正负责结合的因子,但真正执行功能的是A,这样造成的假象很可能就是A直接与DNA结合。我举这个例子不一定合适你的具体情况,但是我的意思是现在说明他是间接还是直接结合还缺乏证据。至于变构的问题,我先前也有提到过,你不是不可以在文章中提,但是这个只是作为一种假设,因为变构的问题,根据我有限的知识,直接的证据来自于结构分析——如果尚未有这样的结构分析报道护着实验证据,你只能做出猜测。

关于是不是竞争抑制,我还是不能肯定。我只能觉得他是抑制关系,至于竞争性,我觉得需要谨慎。理由前述
结合位点是什么?
能否用物理作用逆转(例如透析)?
结合的动力学?
dnazyme wrote:
结合位点是什么?
能否用物理作用逆转(例如透析)?
结合的动力学?

专业人士来了~~~~~~
结合位点正在做。原来是因为A的同源蛋白E与B结合,且别人做了E与B的结合位点,于是我们也从确定A去结合B的结合区域来进行结合位点的鉴定。由于A目前关于文献报道非常少,所以只能逐渐的缩小结合区域,目前确定了A上的7个氨基酸区域结合B,而且这7个氨基酸区域与E结合B的同源区域时不同的。想到做B结合A的区域,也是最近焦点集中到了PSTAIRE helix才觉得迫切起来的!

多谢westernblotx战友,的确目前没有证明是否直接结合是不够尽善尽美的,有机会在进一步实验的时候会考虑补上这块的!

请教一下dnazyme战友, 物理作用逆转都有哪些方法是简单易行的主流方法,这方面没有接触过,回头看看考虑一下是不是有条件开展! 还有结合动力学的问题,一窍不通!还请多多赐教!

还有不知道通过建立蛋白质三维构象能够预测二者的结合区域呢?

恳请大家赐教!
既然你已经做了“前期试验已经证实,A与B在体外及细胞内结合,A过表达能够抑制作为蛋白激酶的B的激酶活性”
那这个CDK的体外酶活性抑制实验中,怎么没有考虑做一下抑制动力学呢?
要说明它是不是竞争性抑制剂,就要从体外酶学的动力学实验下手。

至于抑制机理和结合位点的研究,结晶或共结晶可能是最直接的方法。
刚刚出差回来,看到了阳光海岛战友提出的建议!谢谢楼上所有战友的意见和建议,学到了好多东西!

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