简介
外周成熟 B 细胞可以分为多个亚群。传统上根据表型、组织学定位和功能特点的不同将 B 细胞分为 CD5+ 的 B1 细胞和 CD5 的 B2 细胞两个亚群。
B 细胞主要功能是分泌抗体参与体液免疫。在一定情况下，B 细胞也可以分泌细胞因子，发挥免疫学调节作用，并根据分泌细胞因子的不同将 B 细胞分为不同效应功能的亚群，调节性B细胞通过产生负性调控因子 IL-10 发挥作用。
材料与仪器
试剂：
（1）布雷菲德菌素 A（brefeldin A，BFA）或莫能霉素（monensin）。
（2）Fc 阻断剂。
（3）1x 磷酸盐缓冲液（1xPBS）。
（4）染色缓冲液（1xPBS＋0.1％BSA＋0.05％ 叠氮钠）。
（5）细胞固定液（4％多聚甲醛）。
（6）破膜液（1xPBS＋0.1％牛血清白蛋白＋0.05％叠氮钠＋0.1％皂苷）。
（7）含10％ FCS 的 RPMI 1640 培养液、含有5％FCS的PBS。
（8）荧光标记的 mAb。
仪器：
流式细胞仪
步骤
B细胞功能亚群鉴定的基本过程可分为以下几步：
（1）制备细胞悬液：用含 10％FCS 的 RPMI 1640 培养液重悬细胞，调整细胞浓度为 2x106／ml，进行体外培养。
（2）细胞体外培养
1）具体刺激物的选择参见 B 细胞活化条件，或者用特异性抗原刺激细胞。
2）设置不加任何刺激剂的阴性对照组。
3）每个培养条件加阻断剂 BFA（检测IL——10时，用莫能霉素）。
4）37℃、5％CO2 培养箱中孵育 6 小时以上。
（3）荧光素抗体标记细胞：
1）表面分子标记：将0.5x106——1x106个细胞重悬于 100μl 的染色缓冲液中，在标记前加入 Fc 阻断剂（CD16／CD32），以防止Fc受体结合抗体；根据实验设计方案，加入足量的荧光素标记的表面分子抗体到细胞悬液中；4℃ 避光孵育30分钟；用染色缓冲液洗涤2次。
2）固定细胞：弃上清，加入 4％ 多聚甲醛，500μl／管，混匀，室温避光8分钟；用染色缓冲液洗涤2次。
3）破膜：弃上清，用破膜液重悬细胞（若只分析细胞表面分子，则无需进行固定破膜），200μl／管，4℃，放置至少2小时或者过夜；用染色缓冲液洗涤2次。
4）用染色缓冲液重悬细胞，100μl／管；根据实验设计，加入相应的染色抗体，混匀，4℃避光孵育30分钟；用染色缓冲液洗涤2次；弃上清，用150——200μl的洗液重悬，4℃避光放置，等待上机。
5）上流式细胞仪获取数据及分析数据。
来源：丁香实验
