【求助】肾上腺细胞原代培养--老是污染

本人初做细胞，想各位大虾多多指教。不胜感激。

目前的课题做wista大鼠肾上腺细胞原代培养，（也可以做人肾上腺细胞，可以买的到，考虑到没有经验，加上大鼠肾上腺提取也可以做）。



试 剂：hank‘s缓冲液（漂洗用），培养基【DMEM/F12，gibco胎牛血清（用10%），双抗（青链）（用1%）】，胰酶（用大概0.1%），胶原酶1型（用0.1%），透明质酸酶（未到货）

主要仪器:常规东西（枪头，酒精灯，打火机等），3套取材器械，400目不锈钢网筛，5ml培养瓶（进口），2ml刻度吸管



一共做了2次，原代细胞提取。第一次灭菌操作不到位。第二次汲取教训，器械仪器经清洗--烤干--报纸包好--高压--烤干处理，超净台用酒精擦拭，紫外灯照30分钟-1小时。操作时戴口罩手套。但结果不好，老是污染。图片见附件。说明一下，之前的胰酶，DMEM/F12和gibco胎牛血清在其他地方（一般实验台）打开取用过1次。

1.请大家帮忙看看是什么细菌污染？怎么防治

2.提取的细胞很少，我的消化程序是这样的：肾上腺用剪刀剪碎，用大概0.1%胰酶消化20分钟，没有放在37°水浴（细胞间没有水浴箱），感觉消化的不太好，就用一个400目的筛子，放在15ml离心管的口子上过滤，未分散的组织块用玻璃棒在网筛上面研磨，然后用水冲下去。（导致了筛网洗不干净）。这个过程问题在哪里？还有这个筛网怎么洗干净？

3.今天给第二次提取的细胞换液（隔提取细胞60小时）的时候，观察到培养瓶里面的培养基还是红色的。放在冰箱里面的培养基有少许沉淀，感觉颜色有点变黄。换液之后，培养瓶里面的东西明显增多，不知道是不是细菌？如果是的话，那说明我的培养基污染了，是把DMEM/F12换了，还是把DMEM/F12和gibco胎牛血清一起换，毕竟gibco胎牛血清要800多，还是有点舍不得啊？



第一次的细胞：全是这样的东西，不知道是什么，400倍







第二次提取的细胞，在换液体之前：200







换液之后，感觉“细菌”更多，不知道是什么东西，请大虾赐教200和400各一张

还有两张片子

应该是真菌污染，你可以看到菌丝。



真菌防不胜防，一旦污染，很难根除。你需要全面的清理，我一般用一次性的cell strainer,而不用不锈钢网筛。



good luck!

细胞原代培养是细胞实验的一个大难题，经常容易污染，不知道大家是否会遇到lz这样或者其他麻烦的问题，又是如何处理的？

严格无菌操作！你那是实验动物没有消毒干净，活力碘泡30分钟，然后酒精洗5分钟在做，动物一定要消毒干净不然白做。

肯定是真菌的感染了！赶紧换了，别污染其他的了。

真菌感染了。没得救。处理了吧。

感谢各位大侠的帮助，针对于前段时间的污染情况，本人已经作如下处理：

所有的器械和器皿，均使用前一天高压灭菌烘干过的。提取大鼠肾上腺细胞时戴手术室用灭菌手套。

超净台每次酒精全擦洗，紫外线消毒30min，

所有试剂全部更换

使用一次性巴氏消毒3ml吸管

换液时，拿出，和放进培养箱各喷一次75%酒精。

至于37°，5%CO2 培养箱，目前细胞生长较好，培养10天，未见污染。

目前问题：1、之前文献上要求培养条件为5%CO2 ，95%O2,我们没有用O2

2、培养结果显示细胞很小，100倍镜，比芝麻还小。具体图片改天上传

3、对于细胞系的鉴别，文献上说用3b-羟基类固醇脱氢酶，请教泌尿外科的同学说可以测定皮质酮含量来鉴定，具体鉴定方法目前本人不清楚，希望大虾们给点意见，

楼主你好，不知道你现在的实验进展如何。
我也在做wistar大鼠肾上腺皮质细胞的原代培养，现在细胞密度在逐渐改善，但不知道应该如何鉴定？请问你是用什么样的细胞鉴定方法呢？
谢谢！祝顺利！