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【求助】变异位点检测

丁香园论坛

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老板想检测某个基因在癌组织与癌旁组织中是否有碱基突变,请问一下大家应该怎么做?






顶起来!
主要用PCR吧。

如果谨慎些,可以从宏观到微观选用方法,例如,宏观上看看有没有易位、缺失之类的片段变化可以用核型分析之类的手段,最后再研究是否有点突变,例如chip、pcr等。

还有很多新花招,FRET之类的,你查文献吧。
最简单的方法就是PCR扩增出这个片段,然后测序观察,直观明了。
yyyantopbt wrote:
最简单的方法就是PCR扩增出这个片段,然后测序观察,直观明了。


其实这个做起来并不简单。
因为突变并非发生在所有细胞中。
如果你取组织时,没有将癌旁,癌组织,正常组织区分开。
比如你取了一块组织,其中5-10%是突变的,其他都是正常的,那PCR后,一方面会由于正常DNA的数量多,扩增后会更加占优势(也许PCR产物中99.9%全是正常型的),那直接拿去测序,未必就能看到突变的碱基的峰。

可以考虑用抗体染色,然后用激光捕获目的细胞,再提DNA做PCR。或者用高通量测序。
zjubell wrote:
其实这个做起来并不简单。
因为突变并非发生在所有细胞中。
如果你取组织时,没有将癌旁,癌组织,正常组织区分开。
比如你取了一块组织,其中5-10%是突变的,其他都是正常的,那PCR后,一方面会由于正常DNA的数量多,扩增后会更加占优势(也许PCR产物中99.9%全是正常型的),那直接拿去测序,未必就能看到突变的碱基的峰。

可以考虑用抗体染色,然后用激光捕获目的细胞,再提DNA做PCR。或者用高通量测序。

这些考虑很有道理,不过,大部分的癌组织都是来自于单克隆。也就是说,假如该突变是引起癌变的原因,那么,它们的突变应该是一致的。

更深入,就应该到肿瘤版讨论了。当肿瘤恶性化以后,发生染色体不稳定,可能会发生再次突变,此时,癌组织细胞才开始有差异。

所以,如果做细了,恐怕首先要进行肿瘤分期。
dnazyme wrote:
这些考虑很有道理,不过,大部分的癌组织都是来自于单克隆。也就是说,假如该突变是引起癌变的原因,那么,它们的突变应该是一致的。

更深入,就应该到肿瘤版讨论了。当肿瘤恶性化以后,发生染色体不稳定,可能会发生再次突变,此时,癌组织细胞才开始有差异。

所以,如果做细了,恐怕首先要进行肿瘤分期。

很多肿瘤组织比较小,做手术时,很容易把癌旁和正常组织切进去的。
所以才有LCM这种工具。要区分是癌组织和癌旁,靠肉眼还真有难度。

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