【求助】ChIP在超声后的电泳检测无DNA是怎么回事呢？
丁香园论坛
5606
有做过ChIP的高手不？
我用冷泉港提供的protocol（http://cshprotocols.cshlp.org/cgi/content/full/2009/9/pdb.prot5279#R42）
1. Add 27 μL of 37% formaldehyde per milliliter of cell culture (in growth medium on tissue culture plates or in tissue culture flasks) while slowly shaking the cells for 10 min at room temperature.
The final concentration of formaldehyde is 1%.
2. Quench cross-linking by adding 100 μL of 1.375 M glycine per milliliter of culture.
3. Treat the cells as follows:
For adherent cells
i. Remove the growth medium and dispose of it appropriately.
ii. Wash cells twice with 10 mL of cold 1X PBS, and then scrape the cells into 1X PBS in a 15-mL conical tube.
iii. Pellet the cells at 1500 rpm for 10 min at 4°C.
For nonadherent cells
iv. Transfer the cells to a 15-mL conical tube.
v. Pellet the cells at 1500 rpm for 10 min at 4°C.
vi. Wash the cells twice with 10 mL of cold 1X PBS.
4. Resuspend the cell pellet in 10 mL of cell lysis buffer for ChIP (cold) and incubate for 10 min on ice.
5. Pellet the cell nuclei at 1000 rpm in a benchtop centrifuge for 10 min at 4°C. Aspirate the supernatant carefully.
7. Resuspend the nuclear pellet in 1 mL of nuclei lysis buffer for ChIP supplemented with protease inhibitors and incubate for 10 min on ice.
8. Proceed with sonication. Ensure that the samples do not foam and are kept as cold as possible.
在完成1-8步骤后用
1. mix 20 ul extract + 1ul 10% SDS + 0.5 ul proteinaseK
2. incubate 1hr at 37 degrees C followed by 2 hrs at 65 degrees C
3. phenol/chloroform extract the samples
4. chloroform extract the samples
5. EtOH ppt DNA with 10 ug/ml glycogen (final concentration)
6. resuspend DNA in 20 ul TE
7. treat with 40 ug/ml RNAse for 1hr at 37 degrees C
8. run half of each sample on a 1.5% agarose gel with EtBr with an appropriate DNA sizing ladder (sheared DNA should run between 100 bp and 1000 bp)
步骤提取DNA后电泳没有DNA条带是怎么回事呢？
期待高手解答
我用冷泉港提供的protocol（http://cshprotocols.cshlp.org/cgi/content/full/2009/9/pdb.prot5279#R42）
1. Add 27 μL of 37% formaldehyde per milliliter of cell culture (in growth medium on tissue culture plates or in tissue culture flasks) while slowly shaking the cells for 10 min at room temperature.
The final concentration of formaldehyde is 1%.
2. Quench cross-linking by adding 100 μL of 1.375 M glycine per milliliter of culture.
3. Treat the cells as follows:
For adherent cells
i. Remove the growth medium and dispose of it appropriately.
ii. Wash cells twice with 10 mL of cold 1X PBS, and then scrape the cells into 1X PBS in a 15-mL conical tube.
iii. Pellet the cells at 1500 rpm for 10 min at 4°C.
For nonadherent cells
iv. Transfer the cells to a 15-mL conical tube.
v. Pellet the cells at 1500 rpm for 10 min at 4°C.
vi. Wash the cells twice with 10 mL of cold 1X PBS.
4. Resuspend the cell pellet in 10 mL of cell lysis buffer for ChIP (cold) and incubate for 10 min on ice.
5. Pellet the cell nuclei at 1000 rpm in a benchtop centrifuge for 10 min at 4°C. Aspirate the supernatant carefully.
7. Resuspend the nuclear pellet in 1 mL of nuclei lysis buffer for ChIP supplemented with protease inhibitors and incubate for 10 min on ice.
8. Proceed with sonication. Ensure that the samples do not foam and are kept as cold as possible.
在完成1-8步骤后用
1. mix 20 ul extract + 1ul 10% SDS + 0.5 ul proteinaseK
2. incubate 1hr at 37 degrees C followed by 2 hrs at 65 degrees C
3. phenol/chloroform extract the samples
4. chloroform extract the samples
5. EtOH ppt DNA with 10 ug/ml glycogen (final concentration)
6. resuspend DNA in 20 ul TE
7. treat with 40 ug/ml RNAse for 1hr at 37 degrees C
8. run half of each sample on a 1.5% agarose gel with EtBr with an appropriate DNA sizing ladder (sheared DNA should run between 100 bp and 1000 bp)
步骤提取DNA后电泳没有DNA条带是怎么回事呢？
期待高手解答
可能DNA量太少。
检测DNA浓度没有？
建议你还是直接用upstate的试剂盒做。
检测DNA浓度没有？
建议你还是直接用upstate的试剂盒做。
你贴出来的这个protocol似乎还少了关键的两步，
1）与抗体孵育，让抗体和目的蛋白+DNA结合；
2）加入氯化钠在65度水浴解交联，释放出DNA。
从你的帖子来看，你这次的实验可能只是一个预实验，用来摸索sonication的条件，所以上述步骤1可以省略，但是步骤2应该不能少，蛋白质和DNA交联在一起是否可以直接酚氯仿提取DNA，我没有经验，建议你再取一些sample，先解交联，然后再蛋白酶K消化提取DNA试试，只要你的10cm dish 细胞数能达到300万，理论上应该能在DNA胶上看到很亮的带。
另外，我注意到你先用10ml lysis buffer，然后离心取沉淀，再用1ml lysis buffer，最后只取了20ul 来提DNA，可能确实量少了点，为什么不能多点呢？100ul如何？
另外，建议你参考Upstate公司ChIP试剂盒的protocol来做，不一定要买他的kit，因为kit里面的各种buffer都可以自己配制，这个protocol似乎在文献中应用的更普遍。我贴一份出来，希望对你有用。
1）与抗体孵育，让抗体和目的蛋白+DNA结合；
2）加入氯化钠在65度水浴解交联，释放出DNA。
从你的帖子来看，你这次的实验可能只是一个预实验，用来摸索sonication的条件，所以上述步骤1可以省略，但是步骤2应该不能少，蛋白质和DNA交联在一起是否可以直接酚氯仿提取DNA，我没有经验，建议你再取一些sample，先解交联，然后再蛋白酶K消化提取DNA试试，只要你的10cm dish 细胞数能达到300万，理论上应该能在DNA胶上看到很亮的带。
另外，我注意到你先用10ml lysis buffer，然后离心取沉淀，再用1ml lysis buffer，最后只取了20ul 来提DNA，可能确实量少了点，为什么不能多点呢？100ul如何？
另外，建议你参考Upstate公司ChIP试剂盒的protocol来做，不一定要买他的kit，因为kit里面的各种buffer都可以自己配制，这个protocol似乎在文献中应用的更普遍。我贴一份出来，希望对你有用。
zitong1983 wrote:
你贴出来的这个protocol似乎还少了关键的两步，
1）与抗体孵育，让抗体和目的蛋白+DNA结合；
2）加入氯化钠在65度水浴解交联，释放出DNA。
从你的帖子来看，你这次的实验可能只是一个预实验，用来摸索sonication的条件，所以上述步骤1可以省略，但是步骤2应该不能少，蛋白质和DNA交联在一起是否可以直接酚氯仿提取DNA，我没有经验，建议你再取一些sample，先解交联，然后再蛋白酶K消化提取DNA试试，只要你的10cm dish 细胞数能达到300万，理论上应该能在DNA胶上看到很亮的带。
另外，我注意到你先用10ml lysis buffer，然后离心取沉淀，再用1ml lysis buffer，最后只取了20ul 来提DNA，可能确实量少了点，为什么不能多点呢？100ul如何？
另外，建议你参考Upstate公司ChIP试剂盒的protocol来做，不一定要买他的kit，因为kit里面的各种buffer都可以自己配制，这个protocol似乎在文献中应用的更普遍。我贴一份出来，希望对你有用。
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非常非常感谢你的指点，你说到加入氯化钠解交联，那具体的浓度是多少呢？
还有蛋白酶K消化时的工作浓度呢？
完了以后要用什么方法来提取DNA呢？
原谅我对ChIP实在是很无知啊。
还有就是，我刚来丁香园，没有丁当，无法下载您提供的附件啊。
能否麻烦您帮我发到邮箱不？Wang.Sjuan@hotmail.com
你没有解交联，DNA在样品孔里。
用终浓度0.2M Nacl 65度解交联过夜，跑胶看看。
用终浓度0.2M Nacl 65度解交联过夜，跑胶看看。
请问楼上的suiguo：
只用NaCl解交联然后带着蛋白一起跑胶可以吗？我试过貌似不太行哎~
只用NaCl解交联然后带着蛋白一起跑胶可以吗？我试过貌似不太行哎~
本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴
师兄微信号：shixiongcoming
