【求助】关于构建目的基因启动子序列的虫荧光素酶报告基因重组质粒的问题请教

最近想做虫荧光素酶报告基因，但是从来没有做过，想求院子里高手指教：

我是要观察一种药物是否能作用于细胞内的几种核受体（NFkB，PPAR，ER（目前还不清楚究竟是哪个，需要分别试验））的启动子区域，影响这几个核受体的转录水平，从而影响细胞的一些功能（比如凋亡等）。计划将这三种核受体的启动子区域分别扩增出来，然后与虫荧光素酶（或其他报告基因）构建重组质粒。再分别转染细胞，加入药物处理，观察荧光素酶的活性，以探索药物是否对这几种核受体的启动子有影响。

有以下问题请教：
1）我如何找到这几种核受体NFkB，PPAR，ER的启动子序列：我在院子里搜索了，好像有几个网站，包括genebank可以找，但是找的范围都太大，不知道有没有同仁做过人的这几个基因的，可以将启动子序列告知，万分感谢！
2）构建重组质粒的时候：是否不仅仅要构建目的基因启动子+无启动子的荧光素酶报告基因的重组质粒，而且还要构建目的基因启动子+有启动子的荧光素酶报告基因重组质粒？另外，我的目的基因的启动子是否可以启动荧光素酶报告基因？如何确定？
3）我这样的实验思路，是否可以探索药物对这几个基因启动子以及基因的转录水平的影响？是否有不妥之处？请高手指教？
4）这个试验确实没有做过，有没有经验可以告知，万分感谢!
下半年答辩，时间紧迫，感激为盼！

继续等待中。。。

继续求助中。。。

像NFkB的双荧光素报告基因质粒应该有现成的商品化质粒可买吧，犯不上自己构建吧，你可以上网查查或者问一下公司。

太好了，谢谢楼上的，碧云天公司有！
另外，不知道谁能提供雌激素受体（estrogen receptor，ER）的带荧光素酶的报告重组质粒？或者能告诉我那些地方可以买到？万分感谢！

Why you do not do Real time PCR? you could test three genes with one drug stimulation simtaneously

1，有商品化的荧光素酶报告系统来分析启动子活性的载体，你需要做的是把自己的启动子加在上面就可以了。然后通过细胞转染，（相应的处理）通过测定报告基因的活性来评估启动子的效率。
2，真核启动子核心元件包括TATA box 与转录起始序列，只要有这两部分即可以行使最基础的功能，当然还有很多调控元件在里边的，根据自己的要求来决定启动子长度及位置。

您好!我刚好做过你所要进行的工作，有几点可以和你交流：
1、你可以首先进行核因子的Real time PCR和Western blot，证实的确是在转录水平进行调控的，然后才有必要也必须进行启动子水平的研究。如果不是在转录水平进行的，做启动子报告基因检测是没有意义的。因为基因表达调控不仅仅只在转录水平才能发生。
2、启动子报告基因载体很多公司都有卖的。自己构建也很简单，你只需要在NCBI里边找到核因子转录起始位点之前的大约2000bp和起始位点之后大约200bp的序列，然后设计针对PGL系列载体的引物，扩增然后进行常规分子克隆就可以了。
3、因为目的即是要检测启动子活性，因此构建的就是包含了核因子启动子序列的萤虫素酶报告基因载体。当然，在进行这个检测时还需要海肾素报告基因载体作为内参照，Encher作为阳性对照。具体的，看看化学发光和PGL系列载体说明书就知道了。
希望我说的对你能有所帮助！