【求助】关于组织特异性启动子的结构的问题

我有一个真核表达载体，包含一个Iba1启动子，来源于巨噬细胞的特异性基因Iba1，因此是个组织特异性的启动子，用来控制GFP的表达。启动子的结构见图1，其中加框部分是外显子序列。载体的结构见图2。

载体的构建人说，这个载体的开放阅读框起始是Iba1基因自身的ATG，也就是图1里面Exon1内部加了下划红线ATG，GFP的起始密码ATG也是在一个读码框内。因此，这个载体最后表达GFP蛋白，并且N端融合了Iba1的外显子编码的17个氨基酸。

我在做自己的目的基因表达载体时，把这个启动子用EcoR I和Hind III酶切了出来，克隆到了另一个载体里面，然后发现我目的基因的ATG和Iba1外显子1的ATG不在一个读码框里面了，也就是说我目的基因的ATG到Iba1的ATG中间是179个碱基。现在，我的问题是：

1.这个启动子后面直接是自身基因的第一个外显子，第一个内含子，和第二个外显子的一部分，相当于是基因组来源的序列。当被克隆到表达载体的时候，在真核细胞里面，内含子部分的序列仍然能被剪切掉？不被翻译成蛋白序列？

2.在我克隆的载体里面，目的基因的ATG和启动子自身基因的ATG不在一个读码框，这个载体还可能表达我的目的基因吗？也即有没有可能启动密码变成我目的基因的ATG？

3.内含子序列含有一个TAA，为什么这个TAA不会被当做终止密码子？

4.为什么图1里面起始密码子ATG在Exon1的内部？ATG前面加框的是什么结构呢？

图1.

图2.

1. yes. the intron will be cut out.

2. no. the first ATG will the start of the protein, which is the native protein.

3. again, the intron will be cut out, so the TAA will not exist.

4. ATG the start codon is the first one that show up in mRNA, in your case, locates in exon 1.

Song333，感谢你的回复。
回到我的问题2：我目的基因的ATG已经不在native protein 的读码框了，那这个质粒还可能表达吗？

从理论上来说，native protein 的读码框发生移位，可能就不work了。有没有可能下游的目的基因的读码框开始work了呢？

My answer is your gene will not be expressed. Only the first ATG will be recognized as start codon.If ORF was shifted, your ATG is not ATG anymore.

Yes, it's possible providing alternative translation initiation occuring.

这几天做了一个验证实验，因为我的载体是个慢病毒载体，所以就用293细胞包了病毒，然后转导了一个属于macrophage的细胞系，结果GFP表达非常好！

虽然Iba1这个基因在小鼠内没有报道splice variants，但是这个基因在小鼠和人之间的同源性很高，而人里面已经报道了三个variants，所以现在考虑小鼠里面也有splice variants.也就是说在存在 bigbang 战友所说的alternative translation。

应版主号召，贴个小胶质细胞（ES derived）转导效果图，可见GFP的表达效果还是挺好的。

慢病毒转导效率还是蛮高的，学习了！

慢病毒转导效率还是蛮高的，学习了！