【求助】关于双报告基因
丁香园论坛
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做miRNA的报告基因，用的是miRNA mimics 和miRNA inhibitor转染.结果与对照相比，荧光强度miRNA mimics >对照〉miRNA inhibitor。本人第一次做双报告，望指教！
结果与想要的正好相反。
请问你的荧光强度相差多少？建议下次再提问时把问题说得清楚一点。别人更容易直接回答。
请问你的荧光强度相差多少？建议下次再提问时把问题说得清楚一点。别人更容易直接回答。
不好意思，mimics的荧光强度约是对照的1.5倍，对照荧光约是inhibitor的2倍。四复孔均一。
既然四复孔均一，而且结果也有很意义的。我想是否会犯一个我曾经犯过的错误－－把24孔板的左右搞颠倒了？
miRNA转染细胞后可能会引起靶蛋白水平的升高，但在报告基因水平应该不会存在不降反而升高的情况。建议再重复一两次看看是否有重现性。
miRNA转染细胞后可能会引起靶蛋白水平的升高，但在报告基因水平应该不会存在不降反而升高的情况。建议再重复一两次看看是否有重现性。
记得06还是07年 PNAS的一篇文章说dsRNA转染会让某些目标蛋白水平在初始抑制后反而上升，这种现象一般好像出现在48小时以后，具体机制不太清楚，不知道这个reporter assay会不会有类似的现象。
学习一下！！
谢谢大家的提醒，我很确定96孔板没有加反。那篇文章说转入siRNA反而导致靶基因升高的文章我也看过，但也不能解释阿。打算再重复一次，有结果再和大家探讨。
我也是有过这样的事情，盼高手指点！！！
希望大家热烈讨论！
发表点个人见解，欢迎批评指正！！
该现象很可能说明该miRNA与靶不是直接的关系！！miRNA mimics是模拟生物体内源的miRNAs，运用化学合成的方法合成，能增强内源性miRNA的功能。而miRNA inhibitor是化学修饰的专门针对细胞中特异的靶miRNA的抑制剂。人工合成的miRNAs既能够特异性地沉默单一基因，也可以同时沉默多个相关但不相同的基因。即所谓的“OFF TARTET”现象。最后的实验结果应该是OFF TARGET的总和。
所以要明确miRNA与靶是否直接相关，最好不要用MIMICS，毕竟这只是模拟。不能真正反映该miRNA与靶的直接关系。
所以最好把miRNA连同两侧各200bp左右的序列直接克隆出来，再做实验，观察其蛋白水平及荧光素酶实验结果。
该现象很可能说明该miRNA与靶不是直接的关系！！miRNA mimics是模拟生物体内源的miRNAs，运用化学合成的方法合成，能增强内源性miRNA的功能。而miRNA inhibitor是化学修饰的专门针对细胞中特异的靶miRNA的抑制剂。人工合成的miRNAs既能够特异性地沉默单一基因，也可以同时沉默多个相关但不相同的基因。即所谓的“OFF TARTET”现象。最后的实验结果应该是OFF TARGET的总和。
所以要明确miRNA与靶是否直接相关，最好不要用MIMICS，毕竟这只是模拟。不能真正反映该miRNA与靶的直接关系。
所以最好把miRNA连同两侧各200bp左右的序列直接克隆出来，再做实验，观察其蛋白水平及荧光素酶实验结果。
大家都踊跃发言啊
我这次做出个很奇怪的结果：用了miRNA mimics后靶基因双荧光报告值没下降,(与阴性对照组比较 没变化) 但是用了这个miRNA inhibitor后荧光值却是上调的（做了2次，都是有统计学意义，上调2倍多）,也就是说反面证据是符合预期的 但是正面证据不支持.很头痛！！！ 大家帮我看看这是为什么？
toddy99 wrote:
记得06还是07年 PNAS的一篇文章说dsRNA转染会让某些目标蛋白水平在初始抑制后反而上升，这种现象一般好像出现在48小时以后，具体机制不太清楚，不知道这个reporter assay会不会有类似的现象。
能给全文吗？
不知道细胞密度对这双荧光有没有影响？
呵呵说的有道理,也提醒了我：
1 细胞密度及转染效率也是影响实验结果的很重要的因素，不知你是否能确认转染效率一定没问题。
2：该细胞的microRNA的丰度如何？如果内源性含量比较高的话，外源性的进来可以也不会有太明显的改变，你是否在选细胞株时注意到这个问题。其实抑制相对来说比过表达更容易出现效果，要不找一株该microRNA含量较低的细胞株做做。
暂时就想到这些，再想起来时再补充。
1 细胞密度及转染效率也是影响实验结果的很重要的因素，不知你是否能确认转染效率一定没问题。
2：该细胞的microRNA的丰度如何？如果内源性含量比较高的话，外源性的进来可以也不会有太明显的改变，你是否在选细胞株时注意到这个问题。其实抑制相对来说比过表达更容易出现效果，要不找一株该microRNA含量较低的细胞株做做。
暂时就想到这些，再想起来时再补充。
呵呵说的有道理,也提醒了我：
1 细胞密度及转染效率也是影响实验结果的很重要的因素，不知你是否能确认转染效率一定没问题。
2：该细胞的microRNA的丰度如何？如果内源性含量比较高的话，外源性的进来可以也不会有太明显的改变，你是否在选细胞株时注意到这个问题。其实抑制相对来说比过表达更容易出现效果，要不找一株该microRNA含量较低的细胞株做做。
暂时就想到这些，再想起来时再补充。
-------------------------------------------------------------------------------------------------------对，我是在表达高的细胞上再转的这个miRNA,有可能效果不明显,我现在在考虑换个细胞株试试,有结果就上来汇报一下.
1 细胞密度及转染效率也是影响实验结果的很重要的因素，不知你是否能确认转染效率一定没问题。
2：该细胞的microRNA的丰度如何？如果内源性含量比较高的话，外源性的进来可以也不会有太明显的改变，你是否在选细胞株时注意到这个问题。其实抑制相对来说比过表达更容易出现效果，要不找一株该microRNA含量较低的细胞株做做。
暂时就想到这些，再想起来时再补充。
-------------------------------------------------------------------------------------------------------对，我是在表达高的细胞上再转的这个miRNA,有可能效果不明显,我现在在考虑换个细胞株试试,有结果就上来汇报一下.
这个问题我也很感兴趣，我们之前预测一个microRNA的靶基因，选microRNA低表达的细胞系用EGFP-N和dual-luc做。一个师姐是转染microRNA mimics后24小时靶基因mRNA和蛋白相对control升高，48小时mRNA和蛋白跟control一样；而另一个师姐做的结果是24小时mRNA和蛋白都降低。后来我们仔细推敲，发现mRNA和蛋白都降低是由于转染的miRNA mimics浓度大大超过推荐使用量，调整浓度转染后就是mRNA和蛋白都升高的结果。
现在我也很困惑，我的micoRNA和靶基因匹配得很好，难道真是间接调控？？
有些文献确实说mRNA可以直接上调表达，这里附带几篇文献，有需要的战友请发消息给我：
1，Switching from Repression to Activation: MicroRNAs Can Up-Regulate Translation.
DOI: 10.1126/science.1149460
2，MicroRNA-10a Binds the 5UTR of Ribosomal Protein mRNAs and Enhances Their
Translation. doi:10.1016/j.molcel.2008.05.001
3，Transfection of small RNAs globally perturbs gene regulation by endogenous
microRNAs. dio:10.1038/nbt.1543
现在我也很困惑，我的micoRNA和靶基因匹配得很好，难道真是间接调控？？
有些文献确实说mRNA可以直接上调表达，这里附带几篇文献，有需要的战友请发消息给我：
1，Switching from Repression to Activation: MicroRNAs Can Up-Regulate Translation.
DOI: 10.1126/science.1149460
2，MicroRNA-10a Binds the 5UTR of Ribosomal Protein mRNAs and Enhances Their
Translation. doi:10.1016/j.molcel.2008.05.001
3，Transfection of small RNAs globally perturbs gene regulation by endogenous
microRNAs. dio:10.1038/nbt.1543
有个问题请教，海肾萤火虫双荧光素酶报告载体和EGFP报告载体在miRNA靶基因的鉴定中各有哪些优缺点呢？哪一种更好呢？实验中当如何选用呢？
本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴
师兄微信号：shixiongcoming
