基于 MSTN 基因座的转 IGF-1 基因猪制备技术

基于 MSTN 基因座的转 IGF-1 基因猪制备技术，由于畜禽生物育种和人类重大疾病的动物模型研究需要我们利用现代基因工程技术同时对一个动物基因组的两个或两个以上基因进行修饰，复合性状基因修饰技术已成为基因工程技术发展的主要方向之一。动物的特性往往不是由一个基因决定的，特定经济性状可能与多个基因相关；或者在实际生产中，需要基因工程动物具有两种或两种以上的基因特性。

目前的动物基因工程方法每次转基因只整合一个目的基因，进而制备表达单基因的基因工程动物。如果涉及制备多基因复合性状的基因工程动物，则需单独制备相应的单基因基因工程动物，然后通过基因工程动物间的交配等方法制备转多基因动物的后代，这种制备多基因动物的方法费时、费力而且耗费高。生产实际中多基因复合性状转基因动物更具用价值。

基于 MSTN 基因座的转 IGF-1 基因猪制备技术的基本原理：

利用猪自身的 MSTN 基因调控元件，构建 IGF-1 基因表达载体，使 IGF-1 基因的表达量受到猪自身内源性 MSTN 基因座的调控。并利用该技术制备了转基因猪，该猪不含外源 DNA、真核选择标记、病毒成分和转座子元件，安全性高；可以正常驱动 IGF-1 基因的表达，转基因猪血浆中 IGF-1 水平比阴性猪高出 1 倍，而血浆中蛋白质、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血糖等相关的血液生化指标正常；且该猪的生长速度和瘦肉率均较阴性猪显著提高，具有良好的应用前景。

基于 MSTN 基因座的转 IGF-1 基因猪制备技术可用于改良家畜遗传和培育优良新品种的应用。

器材：PCR 仪、荧光定量 PCR 仪

试剂：

① 湖北白猪肌抑素基因启动子

② 终止子

③ 截短型 IGF-1

④ 设计引物

复合性状转基因动物制备技术的基本过程可分为如下几步：

（一）流程一

载体构建：

将湖北白猪肌抑素基因启动子、终止子、截短型 IGF-1 组装为完整表达框，并在细胞水平进行载体验证。

（二）流程二

转基因猪制备：

通过原核显微注射的法进行制备。

（三）流程三

外源基因整合位点分析：

利用交错式热不对称 PCR（TAIL-PCR）技术对 Fo 和 F1 转基因猪外源基因的整合位点进行分析，三条下游引物的序列分别为：

IV-R1,GCTTATAGATACC GTAGACAT,

IV-R2,TCCCGTGCTCACCGTGACC,

IV-R3,ATCAACTACCGCCA CCTCG。

（四）流程四

拷贝数检测：

采用实时荧光定量 PCR 测定外源基因的拷贝数。内参基因为 TFRC，在单倍体猪基因组内为单拷贝，引物序列为：

TFRC-QF: GAGACAGAAACTTTCGAGC,

TFRC-QR: GAAGTCTGTGGTATCCAATCC，产物长度 81 bp。

目的基因的定量 PCR 引物为：

IGF-1-QF: TGAACCGCATCGAGCTGAAGGG,

IGF-1-QR: ACCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTG，产物长度 130 bp。

转基因拷贝数＝转基因分子数/内参基因分子数 x 2 x 100％。

（五）流程五

转基因猪血液中 IGF-1 的浓度及相关血液生化指标检测：

采集血液，用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法检测猪血液中 IGF-1 浓度，并进行了血液生化指标检测。

（六）流程六

繁殖性能和生产性能统计：

系统开展了基于 MSTN 基因座转 IGF-1 基因猪的产仔数、产活仔数及 21 天平均窝重等繁殖性能及生长性能的测定工作。