CST抗体 Western Blot 问题解答

互联网2013-07-08

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1.Problem：高背景（曝光 1-30 秒后，背景高或无特异性蛋白带）

2.Problem：信号弱（1-30 秒的曝光后检测不到信号）

3.Problem：无着色

4.Problem：着色太浅

5.Problem：着色太深

6.Problem：不正确的染色

Problem：高背景（曝光 1-30 秒后，背景高或无特异性蛋白带）

Problem：高背景（曝光1-30秒后，背景高或无特异性蛋白带）

Cause：一抗的稀释没有使用正确的缓冲液和正确的浓度	Solution：使用推荐的阻断剂和 TBS/T 稀释抗体并 4℃ 孵育过夜。多克隆抗体使用 5% 的 BSA；单克隆抗体使用 5％的脱脂奶粉
Cause：化学发光检测时没有使用相应的膜	Solution：使用高质量的 nitrocellulose 或 PVDF 膜
Cause：膜阻断不足导致一抗或二抗产生大量的非特异性结合	Solution：用含 5％脱脂奶粉的 TBS/T 在室温阻断 1 小时（不能超过一个小时）
Cause：二抗的稀释没有使用正确的缓冲液和正确的浓度，或二抗的特异性差	Solution：一些二抗会与蛋白产生非特异性的结合。因此在检测中可加入一步二抗的对照试验，在没有一抗的情况下，直接加入二抗孵育。也可将二抗用含 5％脱脂奶粉的 TBS/T 在室温下孵育 1 小时
Cause：配制试剂的用水水质不佳	Solution：在配制试剂时（尤其是磷酸化抗体）使用 Milli-Q 或其它超纯的去离子水

Problem：信号弱（1-30秒的曝光后检测不到信号）

Cause：一抗孵育不足	Solution：适当延长孵育时间（4℃ 孵育过夜）
Cause：转膜不完全	Solution：转膜时采用更高的电压和更长的时间。也可采用预染的蛋白 Marker 监控转膜的过程
Cause：阻断膜超时	Solution：阻断膜的时间不能超过 1 小时
Cause：蛋白的表达水平低于检测底限	Solution：在每孔中加入更多的蛋白；先采用免疫沉淀法富集蛋白；换用表达高的样本或细胞；检测前适当刺激蛋白的表达
Cause：二抗与一抗的结合率太低	Solution：提高二抗的浓度或换用与一抗匹配的二抗
Cause：配制试剂时发生交叉污染	Solution：重新配制各种试剂

CST 免疫组化疑难解答

Problem：无着色

Cause：组织切片的质量不好或固定不足	Solution：更换好的组织切片
Cause：底物反应时间太短	Solution：延长底物反应时间，直至出现着色
Cause：不合适的一抗或二抗	Solution：更换一抗或二抗
Cause：没有执行抗原修复	Solution：执行抗原修复
Cause：试剂的配制不正确	Solution：重新配制试剂
Cause：蛋白表达太低	Solution：加入对照试验

Problem：着色太浅

应时间太短	Solution：延Cause：底物反长底物反应时间
Cause：一抗的浓度太低或孵育不足	Solution：提高一抗的浓度（1:50;1:100）
Cause：蛋白表达太低	Solution：加入对照试验

Problem：着色太深

Cause：底物反应时间太长	Solution：减少底物反应时间
Cause：一抗或二抗的浓度太高	Solution：降低一抗或二抗的浓度 2-3 倍
Cause：切片的质量不好	Solution：选用质量好的组织切片
Cause：组织切片没有进行阻断	Solution：用含 5％血清的阻断液阻断 1 小时
Cause：冲洗不完全	Solution：每次冲洗时间不低于 5 分钟
Cause：二抗与样本发生交叉反应	Solution：选用合适的二抗

Problem：不正确的染色

Cause：底物反应时间太长	Solution：减少底物反应时间
Cause：一抗或二抗的浓度太高	Solution：降低一抗或二抗的浓度 2-3 倍
Cause：阻断不足	Solution：延长阻断时间或提高血清浓度
Cause：切片的质量不好	Solution：选用质量好的组织切片

生物秀 Western Blotting 专题：

http://ask.bbioo.com/special/experiment/WesternBlotting.htm