Western Blot抗体杂交

孵育一抗

A. 先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。

B. 配好5%的Milk(TBST溶解)，按要求稀释好抗体。注意，如需高比例稀释，最好采用梯度稀释。

C. 将稀释好的抗体和膜一起孵育。 一般采用RT 1小时，可根据抗体量和膜上抗原量适当延长或缩短时间。

注意：为了便于后面分析结果，我们一般会选用已确定分子量大小而且纯度高的抗体作为marker与一抗同时孵育。

洗涤

用 TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉。然后5mins *5。

洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅。

孵育二抗

孵育 RT1 小时。 一般采用HRP标记的二抗，稀释比例为1:5000。二抗的稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性的结合。注意二抗的选择有多种，要根据一抗来选择抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗，以及根据后面的显色条件来选择HRP、AP或者GOD（葡萄糖氧化酶）酶链的二抗或者标志其他探针（如核素等）的。

洗涤

用 TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉。 然后5mins *5。

洗涤是为了洗去二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。