【原创】miRNA用荧光定量PCR检测的流程以及汇总

最近楼主才回来，由于很长时间不做这方面的工作了，很多新概念和新方法可能跟不上大家了，说的不对请见谅啊。感谢大家的踊跃发言。
最近看到很多战友在做miRNA的荧光定量PCR检测试验。也没看见有专门的讨论帖，拿自己以前做的试验晒晒。开个帖子欢迎大家来提问题、讨论。
另外希望各位战友有用没用千万看贴回个贴阿，以免此帖沦丧无尽之海。:D:D:D:D

目录如下：
一、MiRNA简介
二、反转录引物分类以及设计原理
三、引物探针设计
四、试验操作流程
1、RNA提取
2、反转录
3、荧光定量PCR
一、miRNA简介
小 RNA是 19~28nt的调控RNA分子，主要包括微 RNA(micro RNA，miRNA)和小干涉RNA(short interfering RNA，siRNA)两类，其中的miRNAs成为继 siRNAs之后新的研究热点之一，名列2002年和2003年美国《科学》杂志评出的年度十大科学成就。
miRNAs是长片段RNA序列的一部分，同siRNAs一样是比较短小的单链小分子RNA，一般来源于染色体的非编码区域，由大约70 nt大小的可形成发夹结构的前体加工而来，它通过与其目标mRNA分子的3 端非编码区域(3-untranslated region，3 UTR)互补导致该mRNA分子的翻译受到抑制。
在miRNA公共数据库miRBase (http://www.mirbase.org/)中已经有1W多条来自不同物种的miRNA序列。

MiRNA检测方法
要了解miRNA在基因调控中扮演的角色，很关键的一个方法就是迅速、准确地定量检测miRNA基因的表达。因此，miRNA表达水平的检测也成为了科学家们研究的热点。但是由于小分子RNA是一类很小的分子，部分小分子RNA表达水平可能很低，因而需要极为灵敏而定量的分析工具。常用的检测方法有：
1.1 Northern blotting
1.2 核糖核酸酶保护分析以及基于此方法的液相杂交。
1.3 RT-PCR也被用来检测miRNA前体的表达水平， 其他基于PCR技术检测miRNA的方法有
引物延伸法，就是在引物的5 末端加一个特异标记，可以定量测定低丰度的RNA含量；
原位杂交技术（CISH,FISH）可以方便的检测miRNA的时空表达的差异。
1.4 芯片(microarrays)技术[46,47]是一种较快的研究miRNA表达的方法。