小分子量WB怎么做?
丁香园论坛
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请问小分量的蛋白比如14KD,用三抗是不是更好?
用 三抗有什么优势啊?请大家帮帮忙,wb怎么也做不出来小分子量的
三抗一般就是放大信号吧
做不出来的原因很多啊 不说详细点不好讲
做不出来的原因很多啊 不说详细点不好讲
我就是想请教大家,在什么情况下才用三抗?
楼主您好!
我也做过小分子量的蛋白,大概是15kD左右吧,我没有三抗,我自己的经验是:
1. 电泳的时间一定不要太长,我把积层胶制的很厚,分离胶比平常的要短一些,我用的是15%的分离胶,大概跑了2/3分离胶左右的时候就停了;
2. 转膜我们是湿转,时间我控制在6小时左右,恒压25-27V左右;
3. 小分子量蛋白有时候会被marker的不准确而影响判断,我一般是用两种不一样的marker加在两边,来综合判断分子量,这样更准确;
4. 最后就是抗体了,我通过更换了好几种抗体才成功的,更换效价更高的单抗,这点我认为极为重要,因为本来小分子量的蛋白就很容易弥散,即使上样量很大,抗体浓度很高有时候都很难出来,建议使用高质量的一抗,有条件的设立一个阳性对照组;
5. 当时我是压片子显影的,我直接压了15分钟,呵呵,反正每一步都得改善吧。
希望对楼主有帮助,大家共同讨论。
我也做过小分子量的蛋白,大概是15kD左右吧,我没有三抗,我自己的经验是:
1. 电泳的时间一定不要太长,我把积层胶制的很厚,分离胶比平常的要短一些,我用的是15%的分离胶,大概跑了2/3分离胶左右的时候就停了;
2. 转膜我们是湿转,时间我控制在6小时左右,恒压25-27V左右;
3. 小分子量蛋白有时候会被marker的不准确而影响判断,我一般是用两种不一样的marker加在两边,来综合判断分子量,这样更准确;
4. 最后就是抗体了,我通过更换了好几种抗体才成功的,更换效价更高的单抗,这点我认为极为重要,因为本来小分子量的蛋白就很容易弥散,即使上样量很大,抗体浓度很高有时候都很难出来,建议使用高质量的一抗,有条件的设立一个阳性对照组;
5. 当时我是压片子显影的,我直接压了15分钟,呵呵,反正每一步都得改善吧。
希望对楼主有帮助,大家共同讨论。
[来自丁香园WAP]
关于转膜应该是关键,6小时有点太久了,有没有快点的方法?
关于转膜应该是关键,6小时有点太久了,有没有快点的方法?
低电压,跑一半,半干转用50伏,20分钟。还有,最重要的,你蛋白浓度可能太低。
我经常做小分子量的背景很深
不知道要如何改进啊~~~~~
不知道要如何改进啊~~~~~
槐北路 wrote:
低电压,跑一半,半干转用50伏,20分钟。还有,最重要的,你蛋白浓度可能太低。
没用过半干转,湿转的话,转多久呢?
6小时太久了吧
我也是14左右的分子量,湿转300mA请问多久合适?谢谢~
这个好贴,学习中
圈圈不圆 wrote:
我也是14左右的分子量,湿转300mA请问多久合适?谢谢~
ronaldo_zj
楼主您好!
我也做过小分子量的蛋白,大概是15kD左右吧,我没有三抗,我自己的经验是:
1. 电泳的时间一定不要太长,我把积层胶制的很厚,分离胶比平常的要短一些,我用的是15%的分离胶,大概跑了2/3分离胶左右的时候就停了;
2. 转膜我们是湿转,时间我控制在6小时左右,恒压25-27V左右;
3. 小分子量蛋白有时候会被marker的不准确而影响判断,我一般是用两种不一样的marker加在两边,来综合判断分子量,这样更准确;
4. 最后就是抗体了,我通过更换了好几种抗体才成功的,更换效价更高的单抗,这点我认为极为重要,因为本来小分子量的蛋白就很容易弥散,即使上样量很大,抗体浓度很高有时候都很难出来,建议使用高质量的一抗,有条件的设立一个阳性对照组;
5. 当时我是压片子显影的,我直接压了15分钟,呵呵,反正每一步都得改善吧。
希望对楼主有帮助,大家共同讨论。
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