小分子量WB怎么做？

槐北路 wrote:
低电压，跑一半，半干转用50伏，20分钟。还有，最重要的，你蛋白浓度可能太低。

圈圈不圆 wrote:
我也是14左右的分子量，湿转300mA请问多久合适？谢谢~

ronaldo_zj
楼主您好！

我也做过小分子量的蛋白，大概是15kD左右吧，我没有三抗，我自己的经验是：

1. 电泳的时间一定不要太长，我把积层胶制的很厚，分离胶比平常的要短一些，我用的是15%的分离胶，大概跑了2/3分离胶左右的时候就停了；

2. 转膜我们是湿转，时间我控制在6小时左右，恒压25-27V左右；

3. 小分子量蛋白有时候会被marker的不准确而影响判断，我一般是用两种不一样的marker加在两边，来综合判断分子量，这样更准确；

4. 最后就是抗体了，我通过更换了好几种抗体才成功的，更换效价更高的单抗，这点我认为极为重要，因为本来小分子量的蛋白就很容易弥散，即使上样量很大，抗体浓度很高有时候都很难出来，建议使用高质量的一抗，有条件的设立一个阳性对照组；

5. 当时我是压片子显影的，我直接压了15分钟，呵呵，反正每一步都得改善吧。

希望对楼主有帮助，大家共同讨论。