PCR 基因拼接

PCR片段拼接的SOE和SDL方法


PCR技术（多聚酶链式反应）是现代分子生物学的一个巨大突破，它能在体外迅速、大量、灵敏地扩增基因片段。可是，经PCR技术扩增的大量相关基因片段如何能有效拼接，却是一个很值行探讨的问题。传统的方法是引入限制性内切酶位点，这不但操作繁杂，而有时为了构建限性位点还会影响解读三联密码的正确性。本介绍两种基因 拼接的新方法，即SOE和SDL法，就能巧妙地解决这个问题。
SOE法
1989年，Horton等人提出了SOE法（Gene splicing by over lap extension），即通过复制时DNA链的交错延伸不实现基因拼接。本法可分四步进行。
（1）引物设计：引物a和d是常规引物；b的左半段为常规引物，右半段为基因Ⅱ的引 物序列；c同理；则b和c的部分碱基可互补配对。
（2）基因I、Ⅱ分别扩增，产物相应为片段A、B和C、D。
（3）两种产物混合，经变性及退火处理，A链和D链部分碱基互补配对，成杂交链。
（4）在DNApolymeraseI作用下，A和D链互为引物和模板，合成出A'D'链，即为基因I 和基因Ⅱ的接接产物。若在引物中引入突变的碱基序列，则在接接产物中，将按预先 设计要求出现定点突变。
SDL法
1991年下半年，Lebedenko等人提出SDL方法（Gene splicing by directed liga-tion），即直接拼接法，它在SOE法基础上又有新的突破。本法的要点如下：
（1）限制性内切酶，EcoRI核酸内切酶（或其它Ⅱs类限制性内切酶）能专一性识别 6bp的非回文序列，并能单向特异性地切断EcoRI识别的6bp以外的1—5个核苷酸，产 生一个以突出的4个核苷酸为结尾的5'末端。因而该伸头末端与酶切位点序列无关， 而是由切点附近的序列决定的。
（2）扩增时实际运用的引物的构建。以exon5的实用引物为例：5'链引物包括常规5' 链引物序列和BamHI识别位点及起密码序列；3'链引物包括常规3'链引物和AC及EcoRI 识别位点。
（3）唯一性末端的形成。经扩增和限制性内切酶处理后可得供拼接的exon5，它的右 侧突出末端TCAC中，TC为原始exon5的一部分，AC为原始exon6的一部分，且TCAC与 exon6的AGTG互补配对，其余类推。因为这种结尾相同的几率为1/259，故可被视作 “唯一性末端”。
（4）把经扩增的exon5、exon6和exon7混合，依据碱基互补配对原则，它们就能按顺 序依次拼接。
显而易见，在SOE法中，退火时的最希望产物是AD，杂交链，但A链和B链，C链和D链 配对的可能性更大，另外还有B、C链的配对，这些都是不利的；而SDL法中就不存在 这个问题。另一方面，由于不需DNApolymeraseI，避免了它在复制中可能带来的错 误，所以，SDL法更优越。