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基因拼接SDL法

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2047
SDL方法(Gene splicing by directed liga- tion),即直接拼接法,在SOE法基础上又有新的突破:
  (1)限制性内切酶,EcoRI核酸内切酶(或其它Ⅱs类限制性内切酶)能专一性识别 6bp的非回文序列,并能单向特异性地切断EcoRI识别的6bp以外的1—5个核苷酸,产 生一个以突出的4个核苷酸为结尾的5'末端。因而该伸头末端与酶切位点序列无关, 而是由切点附近的序列决定的。
  (2)扩增时实际运用的引物的构建。以exon5的实用引物为例:5'链引物包括常规5' 链引物序列和BamHI识别位点及起密码序列;3'链引物包括常规3'链引物和AC及EcoRI 识别位点。
  (3)唯一性末端的形成。经扩增和限制性内切酶处理后可得供拼接的exon5,它的右 侧突出末端TCAC中,TC为原始exon5的一部分,AC为原始exon6的一部分,且TCAC与 exon6的AGTG互补配对,其余类推。因为这种结尾相同的几率为1/259,故可被视作 “唯一性末端”。
  (4)把经扩增的exon5、exon6和exon7混合,依据碱基互补配对原则,它们就能按顺 序依次拼接。

 

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