流式细胞术的发展历史及流式细胞仪的原理

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实验室的CT-流式细胞仪

流式细胞分析(flow cytometry，FCM)即流式细胞术，是用流式细胞仪 (flow cytometer，FCM)测量液相中悬浮细胞或微粒的一种现代分析技术。它凝结众多不同学术背景、不同科研领域科学家的心血。从流式细胞术的发明、发展直到今天在各个领域应用的拓展，每一步都是诸如电子技术、流体力学、计算机科学、激光技术、生物学、生物技术、高等数学、临床医学、分子生物学、有机化学和生物物理学等学科知识综合运用的结晶。现代流式细胞术更是由于它结合单克隆抗体技术、定量细胞化学技术和定量荧光细胞化学,使其在生物学、临床医学、药物学、材料学等众多研究领域中的应用有更加突飞猛进的发展。流式细胞术的发展史也就是各个相关学科的发展史的缩影。

1、流式细胞术的发展历史

1930年，Casperrsson和Thorell开始致力于细胞的计数;1934年，Moldaven是世界上最早设想使细胞检测自动化的人，他试图用光电仪记录流过1根毛细管的细胞数量;1936年，Caspersson等引入显微光度术;1940年，Coons提出用结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白;1947年，Guclcer运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器;1949年，Coulter提出在悬液中计数粒子的方法并获得专利;1950年，Caspersson用显微分光光度计在紫外(UV)和可见光光谱区检测细胞;1953年，Croslannd Taylor应用分层鞘流原理,成功地设计红细胞光学自动计数器;1953年，Parker和Hutcheon描述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪 的雏形;1954年，Beirne和Hutchcon发明光电粒子计数器;1959年，B型Coulter计数器问世;1965年，Kamemtsky等提出两个设想：(1) 用分光光度计定量细胞成分; (2) 结合测量值对细胞进行分类;1967年，Kamemtsky和Melamed在Moldaven的方法基础上提出细胞分选的方法;1969年，Van Dilla Fulwyler及其同事们在LosALmos，NM(即现在的National Flow Cytometry Resource Labs)发明第一台荧光检测细胞计;1972年，Herzenberg研制出一个细胞分选器的改进型，能够检测出经荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号;1975年，Kochler和Milstein提出单克隆抗体技术，为细胞研究中大量的特异性免疫试剂的应用奠定基础。现今随着光电技术的进一步发展，流式细胞仪已开始向模块化发展，即它的光学系统、检测器单元和电子系统都可以按照实验要求随意更换。进入21世纪，流式细胞术已经日臻完善，成为分析细胞学领域中无可替代的重要工具。

2 、流式细胞仪 的工作原理

流式细胞仪主要由4部分组成：液流系统、光学系统、电子系统、分析系统。它只能检测悬浮的单细胞或微粒的信号。一般是将待测细胞或微粒进行荧光染色后制成悬液标本，在一定气体压力下将待测样品压入流动室，用不含细胞或微粒的缓冲液(又称鞘液)在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测细胞或微粒流成一定角度，使鞘液包绕着细胞或微粒高速流动，形成一个圆形的流束(即鞘流)，待测细胞在鞘液的包裹下单行排列，依次通过流式细胞仪的检测区域，经激发光激发后产生荧光信号。流式细胞仪通常以激光作为激发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管(PMT)接收。光散射信号在前向小角度进行检测，称为前向散射(forward～atter，FSC)，这种信号基本上反映细胞体积的大小;90°散射光又称侧向散射(side scatter，SSC)，是指与激光束-液流平面垂直的散射光，其信号强度可反映细胞部分结构的信息。荧光信号的接收方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。这些荧光信号的强度代表所测细胞膜表面抗原 的强度或其细胞内、核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机采集所测量到的各种信号进行计算处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上，以备日后的查询或进一步分析。检测数据的显示视测量参数的不同而有多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其x 轴为测量的散射光或荧光的强度(可以是线性轴，也可以选择对数轴)，纵轴为相对细胞数。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有256或1024通道数，这视其模/数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的散点图、等高线图或三维的立体视图等。

流式细胞仪 还可以对分析中的目的细胞进行分选提取，它通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷嘴上安装有超高频的压电晶体，可以产生高频振荡，使液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就包含在液滴之中。将这些液滴充上正或负电荷，当带电液滴通过电场,在电场的作用下发生偏转，然后落入相应的收集器之中，从而实现细胞分选。流式细胞仪的分选速度从以往的5000个/s提高到现在的25000个/s。

流式细胞术发展趋势可归纳为：①流式细胞仪从单纯大型仪器发展为适应各种实际应用的便携式、台式、高分辨率、高质量分选的研究型流式细胞仪;②对流式细胞术检测荧光参数，从采用荧光单色、双色分析发展为多色分析，目前最多可同时检测15种荧光信号;③从检测参数的相对定量发展为绝对定量;④从检测参数的手动人工分析发展为利用计算机软件的自动分析; ⑤所采用的荧光试剂，从非配套试剂发展为配套的试剂盒试剂。而这一切，就要求流式细胞仪使用者和科研人员，一定要不断地有意识地学习上述各门学科知识，只有这样才能更好地将流式细胞术应用到生物医学的临床实践和基础科学研究工作中去。