免疫组化常见问题及对策
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1、染色过强
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原因 |
解决办法 |
| 抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长 | 降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）抗体孵育时间：室温 1 小时或 4 ℃过夜 |
| 孵育温度过高，孵育温度超过 37 ℃ | 一般室温 20-28 ℃ |
| DAB 显色时间过长或 DAB 浓度过高 | 显色时间不能超过 5-10 分钟，以显微镜下观察为准 |
2、非特异性背景染色
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原因 |
解决办法 |
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操作过程中冲洗不充分 |
每步冲洗 3×5 |
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组织中含过氧化物酶未阻断 |
可再配置新鲜 3%H2O2 封闭，孵育时间延长 |
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组织中含内源性生物素 |
正常非免疫动物血清再封闭 |
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血清蛋白封闭不充分 |
延长血清蛋白封闭时间 |
3、染色弱
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原因 |
解决办法 |
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抗体浓度过低，孵育时间过短 |
提高抗体浓度，孵育时间不能少于 60 分钟 |
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试剂超过有效使用期 |
及时更换试剂 |
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操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释 |
每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥） |
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室温太低，低于 15 ℃ |
若室温低于 15 度，要改放在 37 ℃孵育箱孵育 30-60 分钟（或 4 ℃冰箱过夜） |
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蛋白封闭过度 |
封闭时间不要超过 10 分钟 |
4、染色阴性
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原因 |
解决办法 |
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操作步骤错误 |
重新试验，设立阳性对照 |
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组织中无抗原 |
设立阳性对照片，以验证实验结果 |
| 一抗与二抗种属连接错误 | 仔细确定一抗与二抗种属无误 |
