免疫组化的经验总结－操作规程

（一）、仪器设备
1 ） 18cm 不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；
2 ）水浴锅

（二）、试剂
1 ） PBS 缓冲液（ pH7.2 ～ 7.4 ）： NaCl 137mmol/L ， KCl 2.7mmol/L ， Na2HPO4 4.3mmol/L ， KH2PO4 1.4mmol/L 。
2 ） 0.01mol/L 柠檬酸盐缓冲液（ CB ， pH6.0 ， 1000ml ）：柠檬酸三钠 3g ，柠檬酸 0.4g 。
3 ） 0.5mol/L EDTA 缓冲液（ pH8.0 ）： 700ml 水中溶解 186.1gEDTA・2H2O ，用 10 mmol/L NaOH 调至 pH8.0, 加水至 1000ml 。
4 ） 1mol/L 的 TBS 缓冲液（ pH8.0 ）：在 800ml 水中溶解 121gTris 碱，用 1N 的 HCl 调至 pH8.0, 加水至 1000ml 。
5 ）酶消化液： a 、 0.1% 胰蛋白酶液：用 0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b 、 0.4% 胃蛋白酶液：用 0.1N 的 HCl 配制。
6 ） 3% 甲醇 -H2O2 溶液：用 30%H2O2 和 80% 甲醇溶液配制。
7 ）封裱剂：
a 、甘油和 0.5mmol/L 碳酸盐缓冲液（ pH9.0 ～ 9.5 ）等量混合；
b 、油和 TBS( 或 PBS) 配制。
8 ） TBS/PBS pH9.0 ～ 9.5 ，适用于荧光显微镜标本； pH7.0 ～ 7.4 适合于光学显微镜标本。

（三）、操作流程
1 、脱蜡和水化
脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置 60 分钟或 60 ℃ 恒温箱中烘烤 20 分钟。
1 ）组织芯片置于二甲苯中浸泡 10 分钟，更换二甲苯后再浸泡 10 分钟；
2 ）无水乙醇中浸泡 5 分钟；
3 ） 95% 乙醇中浸泡 5 分钟；
4 ） 70% 乙醇中浸泡 5 分钟；
2 、抗原修复
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
1 ）抗原热修复
（ 1 ）高压热修复 在沸水中加入 EDTA （ pH8.0 ）或 0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液（ pH6.0 ）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡 5 分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。 10 分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
（ 2 ）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热 0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液（ pH6.0 ）至 95 ℃ 左右，放入组织芯片加热 10~15 分钟。
（ 3 ）微波热修复 在微波炉里加热 0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液（ pH6.0 ）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔 5~10 分钟，反复 1-2 次。适用的抗原有： AR ， Bax ， Bcl-2 ， C-fos ， X-jun ， C-kit ， C-myc ， E-cadherin ， Chromogranin A ， Cyclin ， ER ， Heat shock protein ， HPV ， Ki-67 ， MDMZ ， p53 ， p34 ， p16 ， p15 ， P-glycoprotein ， PKC ， PR ， PCNA ， ras ， Rb ， Topoismerase Ⅱ等。是以高温，高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。甲醛和蛋白水解交联过程中氨基酸侧链上的某些基团 ( 抗原决定簇 ) 如咪唑、吲哚等基团受到影响，通过 120 ℃ 高温或强碱处理后，可使交联打开。

2 ）酶消化方法 常用 0.1% 胰蛋白酶和 0.4% 胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至 37 ℃ ，切片也预热至 37 ℃ ，消化时间约为 5~30 分钟；胃蛋白酶消化 37 ℃ 时间为 30 分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有： Collagen ， Complement ， Cytokeratin ， C-erB-2 ， GFAP ， LCA ， LN 等。
3 、免疫组织化学染色
SP 法
1 ）脱蜡、水化；
2 ） PBS 洗 2 ～ 3 次各 5 分钟；
3 ） 3%H2O2 （ 80% 甲醇）滴加在 TMA 上，室温静置 10 分钟；
4 ） PBS 洗 2 ～ 3 次各 5 分钟；
5 ）抗原修复；
6 ） PBS 洗 2 ～ 3 次各 5 分钟；
7 ）滴加正常山羊血清封闭液 , 室温 20 分钟。甩去多余液体。
8 ）滴加Ⅰ抗 50 μ l ，室温静置 1 小时或者 4 ℃ 过夜或者 37 ℃ 1 小时。
9 ） 4 ℃ 过夜后需在 37 ℃ 复温 45 分钟。
10 ） PBS 洗 3 次各 5 分钟；
11 ）滴加Ⅱ抗 40 ～ 50 μ l ，室温静置，或 37 ℃ 1 小时；
12 ） II 抗中可加入 0.05% 的 tween-20 。
13 ） PBS 洗 3 次各 5 分钟；
14 ） DAB 显色 5 ～ 10 分钟，在显微镜下掌握染色程度；
15 ） PBS 或自来水冲洗 10 分钟；
16 ）苏木精复染 2 分钟，盐酸酒精分化；
17 ）自来水冲洗 10 ～ 15 分钟；
18 ）脱水、透明、封片、镜检。
SABC 法
1) 脱蜡、水化。
2)PBS 洗两次各 5 分钟。
3) 用蒸馏水或 PBS 配置新鲜的 3%H2O2 ，室温封闭 5 ～ 10 分钟，蒸馏水洗 3 次。
4) 抗原修复。
5)PBS 洗 5 分钟。
6) 滴加正常山羊血清封闭液，室温 20 分钟。甩去多余液体。
7) 滴加Ⅰ抗 , 室温 1 小时或者 4 ℃ 过夜或者 37 ℃ 1 小时（ 4 ℃ 过夜后在 37 ℃ 复温 45 分钟）。
8)PBS 洗三次每次 2 分钟。
9) 滴加生物素化二抗 ,20℃ ～ 37℃ 20 分钟。
10)PBC 洗 3 次每次 2 分钟。
11) 滴加试剂 SABC ， 20 ℃ ～ 37 ℃ 20 分钟。
12)PBS 洗 4 次每次 5 分钟。
13)DAB 显色： DAB 显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。
14) 蒸馏水洗。苏木素复染 2 分钟、盐酸酒精分化。
15) 脱水、透明、封片、镜检。