冰冻切片的免疫组化染色操作步骤

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1. 新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片( 也可- 80℃保存)，厚度为 5～6μm。

2. 载玻片可不打底，裱片后，立即用电吹风吹干。

3. 如不马上染色，可密封后- 20℃保存。

4. 染色前用冷丙酮在 4℃固定 10-20 分钟。

5. PBS 洗 2 次，每次 5 分钟，( 必要时应用 0.1%柠檬酸钠+0.1%triton打孔)

6. 3% H2O2灭活内源性过氧化物酶，20 分钟，避光;

7. 用 PBS 洗 2 次，每次 5 分钟;

8. 正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分 (保持组织呈湿润状态,)滴加正常山羊或兔血清 (与第二抗 体 同源动物血清)处理，37℃，15 分钟。

附：正常血清配制 ( 或按试剂盒规定的浓度配制)：按 1:20比例，用 PBS 配制，每张切片需要量按 50μ+5μl (10%抛洒量) 计算。

9.滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37℃ 2 小时(也可置于 4℃冰箱过夜) 。

10.PBS ：5 分钟，2 次(置于摇床) 。

11.滴加生物素化的二抗，37℃，40 分钟。

12.PBS ：5 分钟，2 次(置于摇床) 。

13.滴加三抗 (SAB 复合物) ，37℃，40 分钟。

14.PBS：5 分钟，2 次(置于摇床) 。

15.DAB 显色，镜下观察，适时终止(自来水冲终止) 。

附：DAB 的配制① 储备液(DAB 25mg/ml)的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待完全溶解后分装成 1ml，100μl，50μl ，20μl 等，-20℃，冻存。② 工作液：DAB 储备液 20μl + PBS 1000μl + 3% H2O2 5μl

16.自来水(细水)充分冲洗。

17.苏木素复染，室温，30 秒，自来水冲洗。

18.自来水冲洗返蓝，15 分钟。

19.梯度酒精脱水：80%，2 分钟 95%，2 分钟 100%，2 次，5 分钟。

20.二甲苯透明：I ，II (二甲苯)各 5 分钟

21.封片：加拿大树胶(或中性树胶)封片。