冰冻切片

一、 取材

应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。

二、速冻

1.  将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2 cm）。

2.  如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。

3.  当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10~20 s组织即迅速冰结成块。

4  在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。

5.  若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。

三、固定

1.  样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5~10 min 让OCT胶浸透组织。

2.  取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。

3.  组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30 min。

四、切片

1.  恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5~10um。

2.  切片时，低温室内温度以-15℃~ -20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。

3.  切好室温放置30 min后，入4℃丙酮固定5~10 min，烘箱干燥20 min。PBS洗5 minx3。

4.  进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。可用3%H₂O₂孵育5~10 min，消除内源性过氧化物酶的活性。

五、免疫荧光染色

1.  冰冻切片室温晾干15 min，可用含10%正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可不洗）。

2.  滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液（抗体的量视组织大小而定，原则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸）。

3.  将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4℃过夜。

5.  第二天先将湿盒放到37℃回温1 h，然后吸取片上的一抗进行回收，将切片插入到小染缸PBS冲洗。

6.  滴加用PBS稀释好的二抗（避光）置于分子杂交箱中37℃孵育1小时。回收二抗，切片置于染缸内，PBS洗5 minx3次。

7.  滴加DAPI工作液染核，室温10~20 min（工作浓度0.1%染色15 min）。

8.  回收DAPI，滴加5-10 μl 抗荧光衰减封片剂或中性树胶，用处理干净的盖玻片封片，即可到荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察拍照。

9.  做好的片放在切片盒内，置于4℃冰箱，可保存一周左右。