原理
冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。
在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。
材料与仪器
试剂：新鲜组织、H2O2、酒精、丙酮、PBS、DAPI 工作液、中性树胶；
器材：OCT 速冻架、恒冷箱切片机、烘箱、荧光显微镜。
步骤
一、取材
应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。
二、速冻
1、将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约 2 cm）。
2、如组织块小可适量加 OCT 包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。
3、当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约 10~20 s 组织即迅速冰结成块。
4、在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。
5、若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入 -80 ℃ 冰箱贮存备用。
三、固定
1、样品托上涂一层 OCT 包埋胶，将速冻组织置于其上，4 ℃ 冰箱预冷 5~10 min 让 OCT 胶浸透组织。
2、取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。
3、组织置于样品托上，其上再添一层 OCT 胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上 30 min。
四、切片
1、恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至 5~10 μm。
2、切片时，低温室内温度以 -15 ℃~ -20 ℃ 为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。
3、切好室温放置 30 min 后，入 4 ℃ 丙酮固定 5~10 min，烘箱干燥 20 min。PBS 洗 5 min x 3。
4、进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。可用 3% H2O2 孵育 5~10 min，消除内源性过氧化物酶的活性。
五、免疫荧光染色
1、冰冻切片室温晾干 15 min，可用含 10% 正常山羊血清的 PBS 室温封闭切片 1 小时（此步可不洗）。
2、滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液（抗体的量视组织大小而定，原则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸）。
3、将切片放在加了 PBS 的湿盒，室温孵育 2 小时或 4 ℃ 过夜。
4、第二天先将湿盒放到 37 ℃ 回温 1 h，然后吸取片上的一抗进行回收，将切片插入到小染缸 PBS 冲洗。
5、滴加用 PBS 稀释好的二抗（避光）置于分子杂交箱中 37 ℃ 孵育 1 小时。回收二抗，切片置于染缸内，PBS 洗 5 min x 3 次。
6、滴加 DAPI 工作液染核，室温 10~20 min（工作浓度 0.1% 染色 15 min）。
7、回收 DAPI，滴加 5~10 μl 抗荧光衰减封片剂或中性树胶，用处理干净的盖玻片封片，即可到荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察拍照。
8、做好的片放在切片盒内，置于 4 ℃ 冰箱，可保存一周左右。
注意事项
1、防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。
2、多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。
3、组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水分也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水分就存留于组织中，形成了冰晶。
4、当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。
5、荧光物质均易发生衰减，染色后的样品宜避光保存。
6、在使用抗衰减封片液的情况下可以减缓衰减，但仍宜尽量避光和尽早拍照。
7、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
来源：丁香实验
