冰冻切片免疫荧光

【材料】组织切片、一抗、荧光标记的二抗；

【试剂】固定液、梯度蔗糖、磷酸盐缓冲液、封闭液、DAPI、荧光抗淬灭封片剂；

【仪器】冰冻切片机、荧光显微镜或激光共聚焦显微镜；

1. 冰冻切片一般选择多聚赖氨酸黏附性载玻片，多聚赖氨酸处理载玻片是带强阳离子的，主要用于病理组织切片、液基细胞学涂片,作用是防止玻片掉片。冰冻切片之后如果不即时染色，可将片子放于负八十冰箱。再次取出后可先在室温晾干 15 分钟。然后置 PBS 中浸泡 10 分钟，以去除 OCT；

2. 用组化油笔将待染组织圈好，目的是为了在进行后续孵育抗体时尽量缩小范围，使抗体进行有效的孵育；

3. 0.5%TritonX-100（PBS 配制）室温通透 20 min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；用含 10％ 正常山羊血清的 PBS 室温封闭切片 1 小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干）封闭的目的是通过血清与非特异性位点结合，以消除非特异性染色,提高目的蛋白的准确性和降低背景；

4. 加入一抗（1:100-1:500)，4℃ 孵育过夜。一抗的浓度可以使用抗体的推荐浓度，或可根据抗体的质量选择合适的浓度；

5. PBS 洗 3 次，每次 10 分钟；

6. 加入荧光标记的二抗（1:200），37℃ 孵育 1 小时，此时注意要进行避光操作。常用的荧光素有 FITC（呈现明亮的黄绿色荧光）、rhodamine（呈现明亮的橙红色荧光）；

7. PBS 洗 3 次，每次 10 分钟；

8. 用羊血清稀释 DEPI（1:1000），避光孵育 5 min，目的是染细胞核，10 分钟。除了 DEPI 进行细胞核染色外，也可以选用 Hoechst 染色，一般为蓝色荧光；

9. PBS 洗 3 次，每次 10 分钟；

10. 滴加防荧光淬灭剂之后进行封片，封片时有一个小窍门，即在载玻片的四周点指甲油，可以有效地黏结盖玻片与载玻片。封片结束后，通过荧光显微镜观察结果并拍照。

（1）整个实验过程中勿使表面干燥。

（2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光。

（3）冰冻切片进行免疫荧光之后，需要尽快拍照，防止免疫荧光淬灭。

（4）在进行荧光显微镜拍照时，要根据荧光抗体选择合适的激发光源。