【讨论】如何让ELISA系统更稳定

ELISA检测系统可谓是免疫学反应应用到科研生产中最为广泛最为灵敏的技术手段。可是在新老手操作过程中总是会出现或大或小的问题,本人在刚开始做ELISA时就面临很多困难,虽然有师兄师姐铺路,但还是常常做得一塌糊涂,比如说花板,假阳性,全显色,全部显色,显色比空白还低......自己也为此苦恼过很长一段时间,随着自己技术水平得提高,或多或少地也掌握了ELISA体系的脾气,也是熟能生巧吧,现在做方阵,做ELISA已是轻车熟路了,以前检测一种抗体用整整一下午还算得晕晕的,现在给我十个八个的从包被到显色,一个工作日基本搞定.下面就由我抛砖引玉地来说一下,做ELISA的经验总结:

1.包被原的性质很重要,蛋白浓度,是否降解,这关系到你做出的抗体可不可以被其识别,所以保存抗原很重要,我做重组蛋白时,师兄都严格警告我一定要在冰浴下缓慢融化就是这个道理.还有有的包被原可能不是蛋白,对于生物素和脂类物质或小分子物质我们要事先对其改造再加以包被,我把方法简要的列出如下:①亲和素生物素:先亲和素先包被载体，加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。②脂类物质:可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。③小分子必须依靠和大的蛋白载体偶联后才能固定在固相载体上.

2.包被液的选择，一般选择ph9.6的碳酸盐缓冲液。但有时由于试验的需要，包被原的特殊性也可能采用中性的缓冲溶液来包。应注意以下原理：由于蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用，这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。具体的试验还要有坚固的理论外也要实践，看一下最终可不可以应用到自己试验当中去。常用的包被液除了刚才提到的pH9.6碳酸盐缓冲液，还有pH7.2的磷酸盐缓冲液和pH7-8的Tris-HCL缓冲液等等。

3.封闭：继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。常用封闭剂有：0.05%-0.5%的BSA；10%的小牛血清或1%明胶；脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%－10％）；还有一些稀有用到的各种动物血清（主要为了排除相似蛋白干扰）和酪蛋白等等。但最终选用什么，要依据试验具体来实践。

4.洗涤板：可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。因为聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，为达到分离游离的和结合的酶标记物的目的,清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质,在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。所以在洗板时会有一定误差，人为因素很大（当然有条件的用洗板机除外），洗的不彻底或串了孔，对如此灵敏的ELISA系统可是不小的影响。

5.加抗体标本(和二抗):注意该换枪头时换枪头.标本稀释一般可用pbs稀释,也可用封闭液去稀释.如需加二抗,还要注意二抗的工作浓度,太高浪费,太低则着色浅.

6.显色:显色系统又很多,我们一开始做的时候,要选择适宜的显色系统.注意显色系统酶活性底物的保存HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠.

7.每次做尽量要把阴阳空三个对照做好,如出现问题也好分析.

终于打完了,也到了吃午饭时间了,呵呵.回看一下,写得有点虎头蛇尾了,请各位多多海涵啊,以后有问题可以多多再园子里探讨探讨.我写的也可能只是一些片面之见,欢迎大家及时批评指正和补充.另外个人认为试验还是从实践中来到实践中去的事,新手不用着急

在这里把园子里一些战友的相关资源和遇到的问题罗列如下：

1。ELISA实验的几本必备工具书(英文)
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=68&id=10630144&sty=1&tpg=2&age=0

2.【求助】崩溃：为什么我的Elisa结果如此奇怪？！
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=68&id=9611737&sty=3

3.ELISA--Theory and Practice
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=68&id=10240009&sty=3&tpg=3&age=0

4.【交流】ELISA加样时的防错小经验
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=68&id=10660126&sty=1&tpg=1&age=0

5.体外诊断试剂-超级ELISA优化方案
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=68&id=10660106&sty=1&tpg=1&age=0

6.【求助】如何进行棋盘法检测抗体滴度
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=68&id=10396609&sty=1&tpg=2&age=0