ELISA的质量管理

江苏省临床检验中心 许斌

概述
●ELISA是一种敏感性高、特异性强、重复性好的实验诊断方法，由于其试剂稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素，以及既适宜于大规模筛查试验又可以用于少量标本的检测，既可以做定性试验也可以做定量分析等优点，已广泛应用于微生物学、寄生虫学、肿瘤学和细胞因子等领域。ELISA的影响因素较多，加强质量管理才能充分发挥其方法学的优点。

分析前质控
●人员培训 实验是人操作的，因此检验人员需经过培训，熟练掌握本专业如下几方面的技术知识：
◎检验项目的基本原理 （ELISA原理）；
◎临床意义；
◎熟悉检测技巧，了解易出差错的环节及难点；
◎熟悉检测试剂性能（包括试剂盒组成，包被片段及其组成）；
◎ 熟悉检测仪器的原理及性能；掌握数据处理的能力和质量控制知识。
◎某些特殊项目的检测如抗HIV等需经有关部门组织的专门培训班，考试合格后持证上岗。
分析前质控
◎ELISA原理：1971年Engvall等人把免疫组化的EIA技术应用于临床检验发展为ELISA技术。
特点 ：在固相表面组装免疫活性物质形成"免疫吸附剂"
酶标记免疫活性物质，进行信号放大；
有二步温育反应二次洗涤过程；
灵敏度特异性相对较高。
局限性：只能检测到ng水平
精密度差（批内CV15-20%）；
线性范围窄（一个数量级）；
存在"HD-HOOK"效应。

ELISA原理
●根据检测目的和操作步骤不同有三种基本方法。
●双抗体（原）夹心法 检测抗原（体）的常见方法，应用针对抗原两个不同决定族的两种单抗分别作为固相载体和酶标抗体检测溶液中的抗原（适用于二价以上抗原,不能测 小分子半抗原）。
●间接法 检测抗体的方法，利用酶标记的抗抗体（第二抗体）检测已与固相抗原结合的抗体。
●竞争法 检测抗原或小分子半抗原、抗体，以测抗原为例，使待测抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，结果如待测抗原含量越多，与固相抗体结合的酶标抗原就越少，显色越浅，二者呈负相关。

ELISA原理
今后的发展方向
●聚苯乙烯表面的高级制备。已有的技术是酰肼化（聚二氟乙叉，PVDF）；生物素化；预包被多聚赖氨酸等，均是专利产品。
●酶促信号放大的改变，如酶促荧光、酶促化学发光等。

ELISA临床意义
●各型肝炎的特征及标志物
乙肝二对半的模式及临床意义
HBsAg HBeAg HBcAb-IgG HBcAg-IgM HBeAb HBsAb 临床意义
+　　　　+　　　　- 　　　　 -　　　　-　　　　-　　　　急性HBV感染早期HBV复制活跃
+　　　　+　　　　+　　　　　+　　　　-　　　　-　　　　急慢性HBV感染，HBV复制活跃
+　　　　-　　　　+　　　　　+　　　　-　　　　-　　　　急慢性HBV感染，HBV复制中跃
+　　　　-　　　　+　　　　　+　　　　+　　　　-　　　　急慢性HBV感染，HBV复制低跃

+　　　　-　　　　+　　　　　-　　　　+　　　　-　　　　HBV复制停止或极低
-　　　　-　　　　+　　　　　+　　　　-　　　　-　　　　平静的HBV携带状态，HbsAg

-　　　　-　　　　+　　　　　-　　　　-　　　　-　　　　HBV既往感染，未产生抗-HBs
-　　　　-　　　　+　　　　　+　　　　+　　　　-　　　　抗HBs出现前期，HBV复制低
-　　　　-　　　　+　　　　 -　　　　+　　　　+　　　　HBV感染恢复期
-　　　　-　　　　+　　　　 -　　　　-　　　　+　　　　HBV感染恢复期
+　　　　+　　　　+　　　　　+　　　　-　　　　+　　　　不同亚型ＨＢＶ再感染
+　　　　-　　　　-　　 　　-　　　　-　　　　-　　　　ＨＢＶ－ＤＮＡ整合
-　　　　-　　　　-　 　　　-　　　　-　　　　＋　　　病后或接种疫苗后获得免疫　

试剂盒选择
◎卫生部规定乙肝试剂，丙肝试剂，艾滋病试剂，梅毒试剂及血型试剂必须使用经卫生部生物制品检定所检定合格，并贴有防伪标签的产品，试剂应从灵敏度，特异性，精密度，稳定性，简便性，安全性及经济性作出全面的评价。
◎灵敏度：有二层含义，1）为试剂检出被检物质的最低量的能力；2）为试剂对人群或大量样品中阳性检出的能力（假阴性越少越好），取决于包被物的全面性。
◎特异性：指试剂正确检定不存在的被检物质的能力（无假阳性），取决于包被抗原（体）及标记抗原（体）的纯度及特异性。
◎精密度：ELISA试剂一般指其批内CV，其值应小于15%；定量试剂应同时考察线性范围
试剂盒选择
◎稳定性：试剂在规定条件下能储存的时间，一般采用破坏性试验即将试剂存放于37℃保存，定期测定其灵敏度，特异性和精密度等指标，直到其质量指标开始下降为止，通常认为37℃每稳定一天相当于4-10℃保存一个半月。
◎简便性：指在不影响试剂的前三项指标的前题下，实验和测定步骤越少越好，在定性试验中结果判断简单明了，）定量试验结果计算也应简单。
◎安全性：指试剂对操作者和环境安全无害无传染性。
◎经济性：试剂在同等质量条件下通过大规模生产或技术进步降低成本而市场价格比较合理。
试剂盒选择
◎试剂评价需要有权威的血清考核盘（Panel）进行检测，一般实验室不易从生检所或临检中心取得，每进一次试剂评价一次也很麻烦。可以通过间接的信息对试剂进行选择。
◎根据该试剂生检所批批检定报告，了解其质量水平，按照质量计划选择灵敏度高的或特异性高的试剂；
◎通过询问试剂包被物的组成，如原料来源（基因工程或合成多肽），片段的组合（按比例混合或化学合成），片段的长短等判断试剂的优劣；
◎参考室间质评评价报告中对试剂的评价结果，这比较客观公正，因为统计数字均来自各参评医院，反映了试剂在某一地区的使用情况；
◎根据权威部门发布的试剂评价结果，了解市场上试剂的质量优劣。

仪器质控
为使仪器保持最佳工作状态应建立维护和校正仪器的标准操作程序（SOP），所要控制的仪器包括移液器（加样枪），水浴箱（温箱），洗板机和酶标仪。
◎移液器：ELISA加样量小（5-100ｕl），其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查：吸取刻度指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在±10%以内；
◎水浴箱 经常检查水浴箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有±1℃的误差；
◎洗板机 每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定一般不超过2ul ，人工扣板时，垫纸不湿，定期检查管孔是否堵塞；
◎酶标仪 经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。

附1：酶标仪校正程序
◎滤光片波长精度检查：将不同波长的滤光片从酶标仪上卸下，用UV-2201型紫外-可见分光光度计（波长精度±0.3nm）于可见光区对每个滤光片进行扫描，其检测值与标定值之差为滤光片波长精度。
◎通噵差与孔间差检测：通道差检测是取一只酶标板小孔杯（杯底须光滑，透明，无污染以酶标板架作载体， 将其（内含200ul甲基橙溶液吸光度调至0.500A左右）置于8个通道的相应位置，蒸溜水调零，1于490nm处连续测三次,观察其不同通道的检测器测量结果的一致性，可用极差值来表示。孔间差的测量是选择同一厂家，同一批号酶标2板条（8条共96孔）分别加入200ul甲基橙溶液（吸光度调至0.100A左右）先后置于同一通道，蒸溜水调零,于490nm处检测，其误差大小用±1.96s衡量。
n 零点飘移（稳定性观察）：取8只小孔杯分别置于8个通道的相应位置，均加入200ul蒸溜水并调零，于490nm处每隔30分钟测一次，观察各个通道4小时内吸光度的变化。

附1：酶标仪校正程序
◎精密度评价：每个通道3只小杯分别加入200ul高中低3种不同．浓度的甲基橙溶解，蒸溜水调零，于490nm作双份平行测定，每日测二次（上下午各一次），连续测定20天。分别计算其批内精密度，日内批精密度,日间精密度和总精密度及相应的CV值。
◎线性测定：用电子天平精确称取甲基橙配制5个系列的溶液，于490nm平行测8次，取其均值。计算其回归方程，相关系数及标准估计误差s，并用±1.96s表示样品测量的误差范围.双波长测定评价：取一分甲基橙溶液，分别加入3种不同浓度的溶血液（测定波长为490nm，校正波长为585nm），先后于8个通道检测，每个通道测3次，51比较各组之间是否具有统计学差异，以考察双波长消除干扰组分的效果。
◎一般酶标仪无585nm滤光片，可选用550nm或630nm滤光片。450nm 滤光片的检定选用普鲁兰溶液（校正波长为630nm）
常见酶标仪评价

标本的采集和保存
◎可用作ELISA的标本十分广泛，体液（如血清，血浆，各种积液），分泌物（如唾液）和排泻物（如粪便，尿液）均可作为标本以测定其中的抗原或抗体成分，一般使用血清。
n 标本采集时应尽量避免溶血，因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质干扰立可读方法的结果，可造成假阳性；长菌的标本同样的道理易产生假阳性。
◎抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝剂。
◎标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG聚合，使间接法的试剂本底加深，一般血清置4℃冰箱5天内完成测试。如需保存一周以上则要-20℃冰冻保存，融解时应上下颠倒充分混匀，同时避免气泡。
◎ELISA的灵敏度>1ng/ml水平上,标本间的污染要尽量避免，尤其不应与生化试验用同一管标本.最起码应先做免疫后做生化.
附：内外干扰物质的影响分析
　　　　溶血 　　　脂浊　　 　　RF 　　　　自身抗体 　　AFP　　 补体　　　 肝素　　 EDTA
A　　　 0.165　　　 0.200 　　0.250 　　　0.264 　　　0.186 　　0.146　　 0.183 　　0.126
S 　　　0.023 　　　0.016 　　0.007 　　　0.029 　　　0. 010 　0. 007 　　0.019 　　0.013
A对照　0.151 　　　　0.195 　　0.195 　　　0.195 　　　0 .116 　0.116 　　0.116 　　0.116
S 　　　0.038 　　　0.008 　　　0. 008 　　0.008 　　　0.018 　　0.018 　　0.018 　　0.018
P 　　　> 0.05　　　> 0.05 　　< 0.01 　　< 0.01 　　< 0.01 　　< 0.01 　　<0.01 　　<0.01

分析中质控
◎ELISA实验的结果受操作影响很大，每个步骤包括加样，温育，洗涤，显色，酶标仪读数均应认真负责才能充分发挥ELISA的高灵敏，强特异的优点。
◎因此,应建立实验项目的标准操作程序(SOP)。

加样
◎加样应用微量移液器（加样枪)按规定的量加入微孔板的1/3处避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
◎每次加样应更换吸嘴，做到一人一吸头，以免发生交叉污染;干吸头预先在血清中抽吸三次。
◎样本稀释，目的是为了减少非特异性反应，所以一定要先加稀释液后加样本，特别注意加样后要在微量振荡器上振荡30秒钟，同时注意防止液体溢出。如后面操作步骤中加二种以上试剂时均需振荡混匀。
◎如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去第一滴有气泡的试剂后加样。

温育
◎抗原抗体反应需要在一定温度下（37°C），经过一定的时间才能达到反应的平衡点
◎ELISA边缘效应是由温育形成的。所以温育一般采用能 使反应液温度迅速达到平衡的水浴法。一种放在水浴箱的隔板上，另一种是放在温箱的湿盒里。水要浸至板条的1/3处，不可将板条叠加放置。
◎边缘效应（2ng/mlHBsAg一步法三种不同温育法的结果）
洗涤
◎ELISA是靠洗涤来达到分离结合与未结合抗原抗体复合物及酶标记物的目的，同时洗涤也可将非特异吸附的蛋白质的干扰以及血球、细菌中的酶干扰清除掉。
◎手工洗涤一般采用浸泡方法：1）甩去孔内反应液；
2）用洗涤液过洗一遍（即注满孔后即甩去）；
3）微孔重新注满洗液后浸泡2-3分钟，间歇摇动；
4）甩去孔内液体，拍板，用纸吸干。
重复以上操作至少5次。注意各种试剂盒的洗涤液尽量不要混用。
◎洗板机洗板一定要预先把板架放平，使洗板机上的每个放液和吸液纤孔都能一致地插入孔底，将孔内液体全部吸干，同时要设置一定的浸泡时间。如出现机洗后拍板有较多残留液时应再用手工洗2次以上。关机前要用蒸溜水冲洗管道，避免堵孔。

显色
◎HRP催化底物的一步呈色反应，同样需要一定的时间和温度，
◎ 一定要按照说明书规定的时间温度（一般为37°C，10-15分钟）恒定反应后终止
◎或根据临界值质控血清吸光度值达0.2左右使的时间而恒定反应时间.

酶标仪判读结果
◎显色反应终止后应立刻比色（30分钟内）。
常见的显色系统有OPD和TMB二种，以后者最为常见，而TMB酸不易终止因此必须尽快比色以免影响结果。OPD终止后显棕色，测定波长为490nm；
TMB终止后显黄色，测定波长为450nm，
二种底物的校正波长均用630nm。
使用双波长的优点可以消除反应板条上的划痕手印的干扰。同时要注意反应板应用纸吸干后才能置酶标仪中比色，否则吸光度易出现负值或损坏滤光片。
报告方式
◎定性试验 国内外为便于统一计算，一律按S/C.O方式报告，S为标本A值，C.O即Cut Off值（阳性判定值)
◎夹心法和间接法以S/C.O≥1为阳性；
竟争法与中和法以S/C.O﹤1为阳性
◎Cut Off的计算公式以试剂盒说明书的为准常见的有：
◎A） C.O=2.1×N（当N不足0.05时按0.05计），
◎此公式由P/N>2.1换算而来，常用于夹心法。
◎B） C.O=0.5×N，从抑止率公式换算而来，
◎常用于竟争，中和法
◎C） C.O=N+C（C为常数），用于间接法。
◎D) C.O=C×P+N（C为常数），用于间接法。此公式最客观，但对生产厂家要求很高，阴阳性对照测定值要基本恒定。

报告方式
定量分析 用已知量的标准品作一系列稀释，ELISA测定，绘制标准曲线，结果以绝对量或单位表示。
ELISA的标准曲线每次都要和待测标本做在同一块板上。
◎现有的ELISA定量试剂盒标准曲线只有在较窄的浓度范围内成直线，要得到精确的结果实属不易。
因此严禁用定性试剂盒做定量分析。

灰区概念
把定量分析的正常值范围引入定性分析建立灰区概念，即将CO值上下的一段区域定为阳性可疑，需重复实验或换试剂重测以确定其阴阳性，如仍落在灰区范围内则报告+（阳性）。
灰区概念对血站系统的献血员筛查尤为重要。
灰区的设置有二种：
1）C.O×（1±CV），
CV为该试剂的批内CV (一般在15-20%间）；
2）C.O±2s，s为实验室做室内质控ROC的s。

高值钩镰效应（HD-HOOK）
◎在二位点夹心ELISA中，其剂量反应曲线的高剂量（HIGH DOSE，HD）区段，线性走向不是呈平台状无限后延，而是向下弯曲状，似一只钩子或一把镰刀（HOOK），MILES（1974） 根据此现象写实性地称之为"HD-HOOK"效应。产生该现象的分子机理有"分子变构说"和"浓度效应"等推论。
◎一步法和二步法均存在， 只是前者出现的更早些，大多数是高值低吸光度，很少阴性结果。

高值钩镰效应（HD-HOOK）

质量控制
（Quality Control，QC）

◎英国Whitehead教授建议生化检验工作的质量控制分为4个步骤：最佳条件的变异（OCV）；常规条件的变异（RCV）；病人结果的统计（SPR）；室间质量控制（EQA）。前三个步骤即室内质量控制（IQC）。
◎在GLP概念里QC即指IQC，其定义为：由实验室工作人员采取一定的方法和步骤，连续评价本室工作的可靠性，旨在监测和控制本室常规工作的精密度，提高批内批间样本检验的一致性，以确定检验报告是否可靠或可否发出的一项工作。
◎免疫测定方法的灵敏度和特异性要比生化方法高得多，因此QC手段不能照搬生化模式。分为定性和定量二个方面。
质量控制
（Quality Control，QC）

定性试验：ELISA定性试验的临床意义在于是否检出病原体，与检出量无关，因此QC要保证试验的灵敏度和特异性。生化的质控图方法仅能观察灵敏度而无法监控特异性。
建议使用临界值血清界定法：将试剂盒所设的阴阳性对照作为内对照指示反应；另设临界值、高值质控血清，正常人血清作为外对照，与标本同时检测，临界值S/C.O≥1，高值质控血清S/C.O≥10，正常人血清A值在0.05~0.07之间。
◎阳性质控血清失控（临界值为灵敏度，高值为"HOOK"效应监控）应重做阴性标本；阴性对照失控应重做阳性标本。
◎以表格式记录每块板的外对照实验结果，作为QC资料存档。

质量控制(Quality Control)
◎定量试验：ELISA定量试验常见于肿瘤因子（如AFP，CEA，CA系列），激素类，免疫球蛋白类，这些物质在体内有一定的量（正常范围），超出这个量才呈病理情况，故需定量测定。定量试验的质控方法可参考生化方式。

质量控制(Quality Control)
"即刻性"质控：在开始进行质控时，只需要有3个质控血清测定值即可进行质控。当这组数据扩大到20次有效值时就可以计算RCV的X，s。方法：
（1）先将测定值从小到大排列，X1最小，Xn最大；
◎（2）计算X和s；
◎（3）计算SI上限值和下限值。
◎SI上=（X最小-X）/S， SI下=（X最大-X）/S
◎对照SI表，检查是否出控，
SI上、下限≤规定值，在控；
SI上或下限>规定值，失控。

质量控制(Quality Control)
SI值表（即刻性质控）
N 3 4 5 6 7 8 9 10 11
N(3s) 1.15 1.49 1.75 1.94 2.10 2.22 2.32 2.41 2.48
N (2s)1.15 1.46 1.67 1.82 1.94 2.03 2.11 2.18 2.23
12 13 14 15 16 17 18 19 20
2.55 2.61 2.66 2.71 2.75 2.79 2.82 2.85 2.88
2.29 2.33 2.37 2.41 2.44 2.47 2.50 2.53 2.56


室内质控血清的制备：
◎收集阳性血清(无明显溶血、黄胆、脂肪血和污染血清,到一定量（够本室使用3-6个月的量）；
◎传染性病毒阳性需经56℃、10小时灭活后使用；
◎过滤，除纤维沉淀物；
◎稀释，用正常人血清或10%小牛血清PBS溶液稀释；
◎测定值，与定值参考品进行对比、求值，一般定在Cut Off值附近的阳性值；
◎分装小瓶（每日用量），加盖、贴签，-20℃冻存备用。
不使用质控血清的室内质控
◎操作过程的质量控制（分析前、后质控）
◎试剂盒阴阳性对照或标准浓度系列。
阴对≤0.05 阳对-阴对>0.8 标准浓度落在2s
阳对 > 0.80 ; 范围内

◎病人资料统计，连续观察病人检测结果的资料，并分析该病人其他化验结果的关系。
质量保证
（Quality Aprovment，QA）

◎质量保证的核心内容是室间质评。室间质评是一种回顾性评价，主要控制试验结果的准确性，也是某些定量试验量值朔源。

评价方法
◎1） 发质控物进行调查，这是目前国内外常见的形式，采用定期发放质控物至各实验室，各实验室在规定的日期进行检验，并将结果报至组织者（部、省临检中心）。组织者通过统计分析，再将评价结果寄回实验室，使其了解工作质量，发现问题，提高质量。其缺点为由于各实验室吃小灶或互相打电话修改结果而达不到真正评价作用。
◎2） 现场调查，事先不通知，临时派出人员到各实验室，规定采用常规方法，检测一组标本，进行评价。这种方法可以解决实际问题，进行现场指导，组织者常因人力、物力的原因而不能经常性进行。

成绩计算方法

◎定性试验：检验结果与预期结果一致，得100分，错误不得分，总计实验室的得分。从全部参评单位的得分中求出该批质控物平均分（X）和标准差（s），再通过公式计算出每一个实验室的得分比值（SI）
SI=（实验室得分-平均分X）/平均标准差（s）
SI在0.0-0.9间为良好,1.0-1.9间为优秀,SI为负值时数值越大成绩越差。
◎定量试验
SI=（实验室测定值-预期值X）/预期值的标准差s SI越小，表明越靠近靶值，成绩越好。
0-1.0为优秀,1.1-2.0为良好,>2.0为差。SI无正负之分

质量改进
（Quality Improvement，QI）

◎质量改进的建议来源于三方面：
◎（1）室内质控：提示实验的精密度差，应规范各项操作；
◎（2）室间质评：提示实验的准确性差，应改进设备的准备或更换试剂；
◎（3）病人或医生的报怨：提示实验的偶然误差，应分析实验的质控过程是否达标。

记录
◎所有实验的原始资料均应存档； 所有的记录均应规范登记在册； 原始登记表应记录试剂来源、批号；质控血清的来源及测定值并注明是否在控；签上实验者姓名及审核者姓名。
◎如试验结果对临床诊断有决定意义，其样本应保留，至少与病历保存期一致