噬菌体效价的测定

实验四十九 噬菌体效价的测定

　　一、目的要求

　　学习噬菌体效价测定的基本方法。

　　二、基本原理

　　噬菌体的效价就是一毫升培养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌斑，因此，能进行噬菌体的计数。

　　三、器材

　　大肠杆菌18小时培养液，大肠杆菌噬菌体10^-2 稀释液（用肉膏蛋白胨液体培养基稀释）；

　　含0．9ml液体培养基的小试管4支，肉膏蛋白胨琼脂平板（10ml培养基，2%琼脂，作底层平板用）5个，含4ml琼脂培养基的试管（0．7%琼脂，作上层培养基用）5管，灭菌小试管5支，灭菌1ml吸管10支，48℃水浴箱等。

　　四、操作步骤

　　1．稀释噬菌体

　　(1)将4管含0．9ml液体培养基的试管分别标写10^-3 ，10^-4 ，10^-5 ，和10^-6 。

　　(2)用1ml无菌吸管吸0．1ml10^-2 大肠杆菌噬菌体，注入10^-3 的试管中，旋摇试管，使混匀。

　　(3)用另一支无菌吸管从10^-3 管中吸0．1ml加入10^-4 管中，混匀，余类推，稀释至10^-6 管如图Ⅻ-3所示。

　　2．噬菌体与菌液混合

　　(1)将5支灭菌空试管分别标写10^-4 ，10^-5 ，10^-6 ，10^-7 和对照。

　　(2)用吸管从10^-3 噬菌体稀释管吸0．1ml加入10^-4 的空试管内，用另一支吸管从10^-4 稀释管内吸0．1ml加入10^-5 空试管内，如图Ⅻ-3直至10^-7 管。

　　(3)将大肠杆菌培养液摇匀，用吸管取菌液0．9ml加入对照试管内，再吸0．9ml加入10^-7 试管，如此从最后一管加起，直至10^-4 管，各管均加0．9ml大肠杆菌培养液。

　　(4)将以上试管旋摇混匀。

　　3．混合液加入上层培养基内

　　(1)将5管上层培养基溶化，标写10^-4 、10^-5 、10^-6 、10^-7 和对照。使冷却至 48℃，并放入48℃水浴箱内。

　　(2)分别将4管混合液和对照管对号加入上层培养基试管内。每一管加入混合液后，立即旋摇混匀。

　　4．接种了的上层培养基倒入底层平板上

　　(1)将旋摇均匀的上层培养基迅速对号倒入底层平板上，放在台面上摇匀，使上层培养基铺满平板。

　　(2)凝固后，置37℃培养。

　　5．观察平板中的噬菌斑，将每一稀释度的噬菌斑数目记录于实验报告表格内，并选取 30—300个噬菌斑的平板计算每毫升未稀释的原液的噬菌体数（效价）。

　　噬菌体效价=噬菌斑数×稀释倍数×10

　　五、实验报告

　　1．结果

　　(1)记录平板中每一稀释度的噬菌斑数于下表中。

　　(2)噬菌体效价是多少？

　　2．思考题

　　(1)什么因素决定噬菌斑的大小？

　　(2)测定噬菌体的效价，操作时要注意些什么才能测定准确？