理化因素的诱变效应

实验四十五 理化因素的诱变效应

　　一、目的要求

　　通过实验，观察紫外线，硫酸二乙酯对枯草芽孢杆菌BF7658的诱变效应，并学习理化因素诱变育种的方法。

　　二、基本原理

　　许多物理因素（如紫外线、X射线，γ射线等）和化学因素（如硫酸二乙酯、氮芥、亚硝酸、乙烯亚胺、亚硝基胍等）对微生物都有诱变作用。能够引起诱变作用的这些理化因素称为诱变剂。诱变剂的作用是使菌体内担负遗传作用的物质，主要是DNA的分子结构发生改变，从而引起菌体遗传性变异。然后从群体中选出优良性状的菌株，这在生产、科研中是常用的主要方法。

　　本实验以紫外线和硫酸二乙酯单因子作为诱变剂处理产生淀粉酶的枯草芽孢杆菌 BF 7658为例，根据枯草芽孢杆菌 BF 7658诱变后在淀粉培养基上透明圈直径的大小，来指示诱变效应。一般透明圈越大，淀粉酶活性越强。

　　三、器材

　　枯草芽孢杆菌BF7658；

　　淀粉培养基，0．1mol/LpH7．0的磷酸缓冲液，硫酸二乙酯[简写DES，（C₂ H₅ ）₂ SO₄ ]，碘液；

　　1ml吸管，盛 4．5ml无菌水的试管，无菌生理盐水，玻璃刮棒，血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机，盛玻璃珠的三角烧瓶等。

　　四、操作步骤

　　1．紫外线对枯草芽孢杆菌BF7658的诱变效应

　　（1）菌悬液的制备

　　（a）取培养48小时的枯草芽孢杆菌BF7658的斜面4—5支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。

　　（b）将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。

　　（c）用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升10⁸ 个。

　　（2）平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至45℃左右时倒平板27套，凝固后待用。

　　（3）紫外线处理

　　（a）将紫外线灯开关打开预热约20分钟。

　　（b）取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。

　　（c）将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。

　　(4)稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10^-1 -10^-6 （具体可按估计的存活率进行稀释）。

　　(5)涂平板取10^-4 、10^-5 、10^-6 三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0．1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。

　　(6)培养 将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。

　　(7)计数将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。

　　(8)观察诱变效应 将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5—6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。

　　2．硫酸二乙酯对枯草芽孢杆菌BF7658的诱变效应

　　(1)菌悬液制备

　　(a)将枯草芽孢杆菌BF7658接一环到装有30ml淀粉培养液中，置37℃振荡培养14小时左右（对数生长期）。

　　(b)取上述培养物10ml进行离心（3000r/min离心15分钟），弃去上清液，将沉淀下来的菌体再用0．1mol/LpH7．0的磷酸缓冲液洗涤2—3次，最后用原体积的磷酸缓冲液制成菌悬液。

　　(c)用显微镜直接计数法，调节细菌数每毫升约为10⁸ 个。

　　(2)平板制作将含淀粉的培养基溶化，冷至45℃左右倾注平板，待凝，共27套。

　　(3)硫酸二乙酯诱变处理取细胞数每毫升为10⁸ 个的菌液4ml加入 16ml磷酸缓冲液中，再加入硫酸二乙酯0．2ml，分别振荡处理30分钟及60分钟。

　　(4)中止反应 将已处理的菌液，加入0．5ml 25%的硫代硫酸钠溶液中止反应。

　　(5)稀释中止反应后的菌液以10倍稀释法作一系列稀释至10^-6 （具体可按估计的存活率进行稀释）。

　　(6)涂平板 分别以无菌操作取10^-4 、10^-5 、10^-6 各0．1ml放入已倒好培养基的平板中，每个稀释度重复3个平板，共18个平皿，用无菌玻棒涂匀（注意：以上操作时，因硫酸二乙酯有毒，不能用嘴吸或接触皮肤）。

　　以同样操作取未经硫酸二乙酯处理的菌液稀释涂平板作对照。

　　(7)培养 将上述平板倒置于37℃温箱中培养48小时。

　　(8)计数 将培养48小时后的平板取出进行细胞计数，并计出诱变处理30分钟和60分钟后的存活率和致死率。

　　(9)观察诱变效应将细胞计数后的平板，分别向菌落数约在5—6个的平板内加碘液数滴，菌落周围将出现透明圈，分别量其透明圈的直径和菌落的直径，并计算其比值（ HC比值），与对照进行比较，说明诱变效应。将HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养，此斜面可作复筛用。

　　五、实验报告

　　1．结果

　　将实验结果填入下表。

2．思考题

　　(1)用于诱变的菌悬液（或孢子悬液）为什么要充分振荡？

　　(2)用化学诱变剂处理细菌，为什么要用缓冲液来制备菌悬液？

　　(3)经紫外线处理后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？