实验55 氨基酸含量的测定（茚三酮比色法）

实验55 氨基酸含量的测定（茚三酮比色法）

原理

　　凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。

　　　

　　　

仪器药品

　　721型分光光度计　　　　　　 台天平

　　减压蒸馏器 　　　　　　　　　干燥

　　研钵 　　　　　　　　　　　　容量瓶

　　移液管　　　　　　　　　　　 烧杯

　　试管架　　　　　　　　　　　 试管

　　0.2mol/L柠檬酸缓冲液，pH5.0（见附表2）

　　80%乙醇

　　10mmol/L KCN：称取0.1638gKCN溶于蒸馏水中，稀释至250ml备用（注意：KCN剧毒！）

　　KCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液：称取1.25g重结晶茚三酮溶于25ml经重蒸馏的乙二醇甲醚中使成5%溶液。将2.5ml10mmol/L KCN溶液用乙二醇甲醚溶液稀释至125ml充分混合。然后将125mlKCN—乙二醇甲醚溶与25ml茚三酮－乙二醇甲醚溶液相混合，置试剂瓶待用，正常情况下应为浅黄色。

　　标准氨基酸溶液：称取亮氨酸20mg溶于10ml蒸馏水中，则得浓度为200μg/ml的母液。

　　上述所有试剂必须放在草酸保护的干燥器中，以免被空气中的NH3所污染。

　　乙二醇甲醚(CH3OCH2CH2OH, methyl cellusolve)的处理：将5g硫酸亚铁加在500g乙二醇甲醚中，振摇1─2小时。过滤除去硫酸亚铁（若滤液混浊没有关系），再在蒸馏瓶中蒸馏，收集沸点121─125℃部分，此时应为透明无色液体。KCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液配制后必须隔夜才能应用。配制后1星期内稳定，若超过1星期则灵敏度降低，不宜作定量。

　　茚三酮重结晶：即使AR级的茚三酮，由于保管不当，常带微红色，配成溶液后也带红色，影响比色测定，故需重结晶一次方可应用。5g茚三酮溶于15ml热蒸馏水中，加入0.25g活性炭，轻轻摇动，若溶液太稠不易操作，可酌量加水5─10ml，30分钟后用滤纸过滤，滤液放冰箱中过液，次晨即见微黄色结晶出现，过滤，再以1ml冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，最后装入棕色试剂瓶中保存。

操作步骤

　　1．绘制标准曲线

　　取标准氨基酸母液将其稀释成0.5、1.0、5、10、20、30、40、50μg/ml的一系列浓度。

　　取不同浓度的标准氨基酸溶液1ml，加0.2mol/L柠檬酸缓冲溶液(pH5.0)1ml，充分混和，然后加入1mlKCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液，充分混匀后在100℃沸水浴中加热15分钟，取出立即加入3ml60%乙醇稀释之。然后冷却，在波长570nm进行比色，读取吸光度A570。然后绘制A570－氨基酸浓度曲线，或进行直线回归求得相应的直线公式（参阅读实验86）

　　2．样品的制备

　　称取植物样品3g，于研钵中加少量80%乙醇，研磨成匀浆，移于100ml容量瓶中，用乙醇将残渣洗入瓶中，最后定容至刻度。过滤，取滤液20ml，在室温下减压蒸发干燥，蒸发的最后阶段在表面皿上进行，得到固形物。使用前用蒸馏水溶解，配制成每ml约含样品0.1g的稀释液。

　　3．比色测定

　　与上述制作标准曲线的方法相同。1ml样品（氨基酸含量大约在0.5─50μg），1ml柠檬酸缓冲液，1mlKCN－乙二醇甲醚－茚三酮溶液，在100℃水浴中加热15分钟，取出立即加入3ml60%乙醇稀释之，冷却后即进行比色测定，读取A570（脯氨酸则在440nm波长测定，注意需另行绘制标准曲线）。此法对于一些小肽也可以测定。在多肽合成中常用来检验有无自由氨基的肽类存在。

　　茚三酮与氨基酸所生成的颜色在1小时内稳定，因此加乙醇稀释后，应尽快进行测定。如果读数超过标准曲线范围，可再加60%乙醇稀释之，不使A570超过0.8为宜。

　　4．计算

　　按下列公式计算植物样品中氨基酸含(μg/ml鲜重)。

　　式中x为从标准曲线查得的氨基酸含量(μg/ml)。

　　V为20ml样品蒸干后最后的定容体积(ml)。