茚三酮测定法

茚三酮反应是一种灵敏度高的蛋白实验。游离的氨基酸可以被高敏感性检测出来。这个方法可以被用来继续蛋白质的酶降解。上述的酪蛋白降解在这个实验系统中用作蛋白酶反应。未水解的蛋白质被三氯乙酸沉淀下来，而茚三酮反应发生在上清液。

蛋白酶溶液
​Tris-HCl NaOH 乙酸 三氯乙酸 酪蛋白底物 乙酸缓冲液 KCN 乙醇 标准 BSA 溶液 亮氨酸
水浴锅 分光光度计

1. 酪蛋白降解

0.4 ml 酪蛋白底物恢复到 35℃，0.2 ml 蛋白酶溶液溶于 0.01 mol/L Tris-HCl pH 8.0，加入 10 mmol/L CaCl₂。35℃ 培养混合物，10 min 后加入 1 ml 1.2mol/L TCA 停止反应。用同样的方法处理空白对照，不同点是加入 TCA 后，向酪蛋白底物中加入蛋白酶溶液。离心样品 5 min。

2. 茚三酮反应

0.2 ml TCA 上清液

0.1 ml 0.2 mmol/L KCN 溶于乙酸缓冲液

0.1 ml 茚三酮试剂

在水浴中放置 10 min 或者加热箱中加热到 100℃，而后在冰中冷却 1 min，再加入 0.5 ml 50％ 乙醇。用水取代水解产物后，相对于空白对照检测在 570 nm 处的吸收值。

3. 校准曲线

为了定量，用 12 份（1～50 ul，补充至 200 ul）10 mmol/L 亮氨酸溶液绘制校对曲线。

试剂配制：

0.01 mol/L Tris-HCl，pH 8.0，包含 10 mmol/L CaCl₂（1.47 g CaCl₂·2 H₂O 溶于 1 L）

0.2 mol/L NaOH（Mr＝40.0；0.8 g 溶于 100 ml H₂O）

0.2 mol/L 乙酸（Mr＝60.05；12 g 溶于 1 L）

1.2 mol/L 三氯乙酸（TCA，Mr＝163.4；19.6 g 溶于 100 ml H₂O）

酪蛋白底物：2 g 酪蛋白溶于 90 ml 0.01 mol/L Tris-HCl pH 8.0、10 mmol/L CaCl₂ 和0.2 mol/L NaOH，而后用 0.2 mol/L 的乙酸调 pH 至 8.0，并用 H₂O 将溶液补充至 100 ml。溶液被分为等分试样并储存于 -20℃。

2 mol/L 乙酸缓冲液，pH 5.4［溶解 270 g 三水乙酸钠（C₂H₃O₂Na·3H₂O，Mr＝136.1）于 200 ml H₂O，加 50 ml 冰醋酸并补充至 1 L］

10 mmol/L KCN（Mr＝65.1；65 mg 溶于 100 ml H₂O）；

0.2 mmol/L KCN 溶于乙酸缓冲液（0.2 ml 10 mmol/L KCN＋9.8 ml 乙酸缓冲液，新鲜制备）茚三酮试剂（2，2-二羟基-1，3-茚满二酮，Mr＝178.1，可购买到）

50％ 乙醇

标准 BSA 溶液，40 ug/ml，将储存液稀释 100 倍，100 mg 溶于 25 ml 水中制备而得。

10 mmol/L 亮氨酸（DL-亮氨酸，Mr＝131.2；131 mg 溶于 100 ml 水中）

蛋白酶溶液