蛋白酶的测定实验

生物化学实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

因为蛋白酶具有不同的种类和专一性。蛋白酶可以根据不同的标准进行细分。以催化机制分，有三种不同的类型：丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属-蛋白酶。以进攻底物的方式分为内、外蛋白酶。第三种标准是变化的底物的专一性，如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶类的酶。对于适合的实验，必须考虑到这些划分。特别是当检测新的蛋白酶时，首先要决定的是，测试酶的高专一性还是鉴别蛋白质分裂活性的光谱范围。前者需要特殊的底物，而后者采用许多种蛋白质，对于它们用量很大，因此必须找到能够检测分裂产物的方法。以下，首先描述检测一般蛋白酶活性的方法，然后是特殊的蛋白酶和肽酶。

来源：《酶学实验手册》

来源：丁香实验

操作方法

Anson 测定法

实验所需「试剂」具体见「其他」1. 样品液及空白对照的处理：2. 校准曲线准备 0～250 nmol L-酪氨酸的校准曲线。用 0.2 mol/L HCl 补充 0.2 mol/L L-酪氨酸（1 ul～1 nmol）的递增量（约 12 种不同的样品）直到 0.5 ml，并向每个样品中加入 1 ml 0.5 mol/L NaOH 和 0.250 ml Folin-Ciocalteau 苯酚试剂（1

酪蛋白测定法

实验所需「试剂」具体见「其他」0.4 ml 酪蛋白底物被恢复到 35℃，并加入 0.2 ml 蛋白酶溶液（含 0.01 mol/L Tris-HCl，pH 8.0，10 mmol/L CaCl2）。混合物在 35℃ 孵育 10 min，加入 1 ml 1.2 mol/L 的 TCA 停止反应。用同样方法处理空白对照，不同的是在加入 TCA 之后向酪蛋白底物中加蛋白酶溶液。样品离心 5 min，并取

偶氮酪蛋白测定法

0.5 ml 偶氮酪蛋白溶液0.2 ml 蛋白酶溶液25℃ 时培养 30 min 后，加 0.2 ml 10％三氯乙酸停止反应，离心 5 min。于 340 nm 处测上清液的吸收值，1U 是指 1 h 内，能使吸收值变化 1 的酶量。

茚三酮测定法

1. 酪蛋白降解0.4 ml 酪蛋白底物恢复到 35℃，0.2 ml 蛋白酶溶液溶于 0.01 mol/L Tris-HCl pH 8.0，加入 10 mmol/L CaCl2。35℃ 培养混合物，10 min 后加入 1 ml 1.2mol/L TCA 停止反应。用同样的方法处理空白对照，不同点是加入 TCA 后，向酪蛋白底物中加入蛋白酶溶液。离心样品 5 min。2. 萌三酮反应0.2 ml