溶菌酶的测定

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溶菌酶（ lysozyme ）主要是由吞噬细胞合成并分泌的一种小分子粘性蛋白，属乙酰多糖酶。存在于唾液、乳汁、泪液和鼻及气管等分泌物中，能溶解革兰氏阳性细菌 。由于它的高等电点（ pH11.0 ），使它能与细菌牢固结合，并水解细菌细胞壁肽聚糖，使细菌裂解死亡。

　　本实验在平板上进行唾液酶的测定。溶菌酶与枯草芽胞杆菌（ Bacillus subtilis ）作用后，可使该菌因细胞壁破坏而溶解，致使琼脂 板加样孔周围出现溶菌环。溶菌环直径与样品中溶菌酶含量的对数呈直线关系。

　【材料】

　1• 无菌 PBS （ pH6.4 ， 1/15mol/L ）， 5mol/LKOH ， 3%PBS 琼脂，溶菌酶标准品，受验者唾液。

　2• 枯草芽胞杆菌 12 小时培养物。

　3• 10×100 试管，试管架，无菌平皿，打孔器，微量加样器。

　4• 分光光度计，水浴箱，温箱等。

　【方法】

　1. 菌液配制：将 PBS 加入枯草芽胞杆菌斜面，置室温 5-10 分钟后制成菌悬液；在波长 640nm 处，测定菌悬液的浓度，并将菌液浓度调至透光率 30-40% 。

　2. 溶菌酶标准液配制：称取溶菌酶标准品，用 PBS 配成 1000 m g/ml ，置冰箱冻存，临用时再稀释成 100 、 50 、 25 和 10 m g/ml 。

　3. 收集唾液标本：待检测者用清水漱口后，将唾液收集于消毒平皿内待用。

　4. 加热融化 3% 琼脂，冷至 60 -70℃ ，与预热好的枯草芽胞杆菌菌悬液等体积混合，到平板。用打孔器在平板上打孔，孔间距约 1.5cm , 每平板可打孔 8-9 个。

　5. 各孔内依次加溶菌酶标准品和唾液样品，每孔 20 m l 。

　6. 置于 24 -26 ℃ 12-18 小时后测量溶菌环直径。

　【结果判断】

　记录溶菌环的直径（ mm ）于下表，绘制标准曲线，并从标准曲线上查出所测样品的溶菌酶含量。

　【作业】

　1• 记录标准溶菌酶样品的溶菌环直径，绘制标准曲线。

　2• 记录和报告唾液样品的溶菌酶含量。

图 2-1 唾液样品中的溶菌酶作用与枯草芽孢杆菌产生的溶菌环。上排为溶菌酶标准液作用

　后产生的溶菌环，下排为唾液样品中的溶菌酶作用后产生的溶菌环。