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酪蛋白测定法

相关实验:蛋白酶的测定实验

最新修订时间:

原理

实验中的氨基酸由蛋白酶从酪蛋白中水解下来。在分离出 TCA 沉淀中未分解的蛋白质后,用分光光度测定的方法对其上清液分析,氨基酸来自于酪蛋白。依据酪蛋白校准曲线,已对其量化。这个鉴定不是很敏感。

材料与仪器

酶样品
​Tris-HCl NaOH 乙酸 三氯乙酸 L-酪氨酸 酪蛋白底物
分光光度计

步骤

实验所需「试剂」具体见「其他」


0.4 ml 酪蛋白底物被恢复到 35℃,并加入 0.2 ml 蛋白酶溶液(含 0.01 mol/L Tris-HCl,pH 8.0,10 mmol/L CaCl2)。混合物在 35℃ 孵育 10 min,加入 1 ml 1.2 mol/L 的 TCA 停止反应。用同样方法处理空白对照,不同的是在加入 TCA 之后向酪蛋白底物中加蛋白酶溶液。样品离心 5 min,并取上清液测量其在 275nm 处的吸收值。


一个单位被定义为:35℃ 时,1 min 后,产生相当于校准曲线中 1 umol 的酪氨酸所产生的吸收值的蛋白酶量。校准曲线是用不同浓度的酪氨酸溶液绘制的。

注意事项


常见问题

试剂:


0.01 mol/L Tris-HCl,pH8.0,包含 10 mmol/L CaCl2


0.2 mol/L NaOH(Mr=40.0;0.8 g 溶于 100 ml 水中)


0.2 mol/L 乙酸(Mr=60.05;12 g 加到 1 L)


1.2 mol/L 三氯乙酸(TCA,Mr=163.4;19.6 g 溶于 100 ml 水中)


1 mmol/L L-酪氨酸(Mr=181;18.1 mg 溶于 100 ml 0.2 mol/L HCl)


酪蛋白底物:2 g 酪蛋白溶于 90 ml 0.01 mol/L Tris-HCl pH 8.0、10 mmol/L CaCl2 和 0.2 mol/L NaOH,而后用 0.2 mol/L 的乙酸调 pH 至 8.0,并用 H2O 将溶液补充至 100 ml。溶液被分为等分试样并储存于 -20℃。

来源:丁香实验

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