还原糖含量的测定（ Somogyi-Nelson 比色法）

一.目的

在植物营养及代谢研究中，常需测定还原糖的含量，本实验要求掌握 Somogyi-Nelson 比色法的测定原理。

二、原理

还原糖是具有羰基（＞ C ＝ O ）的糖，能将其他物质还原而其本身被氧化。

(1) 还原糖在碱性条件下加热，在酒石酸钾钠存在的情况下，可以定量地将二价铜离子还原为一价铜离子，即产生砖红色的氧化亚铜沉淀，其本身被氧化。具体反应如下：

CuSO 4 十 2 NaOH → Na 2 SO 4 十 Cu （ OH ） 2

生成的 Cu 复合物与糖反应， Cu 生成氧化亚铜（ Cu 2 O ）。

(2) 氧化亚铜在酸性条件下，可将钼酸铵还原，还原型的钼酸铵再与砷酸氢二钠起作用，生成一种蓝色复合物即砷钼蓝，其颜色深浅在一定范围内与还原糖含量（即被还原的 Cu 2 O 量）成正比，用标准葡萄糖与砷钼酸作用，比色后用做标准，就可测得样品中还原糖含量。

三、仪器、试剂和材料

1 .仪器

（ 1) 分光光度计

（ 2 ）水浴锅

(3 ）具塞刻度试管： 15ml X 10

（ 4 ）吸管： 1ml X 1 ， 2m1X4 ， 5ml X 3

（ 5 ）容量瓶： 100m1 X 2

（ 6 ）漏斗

（ 7 ）研钵

（ 8 ）电子顶载天平

2 .试剂

（ 1) 铜试剂

1 ） 4 ％ CuS0 4 ・ 5H 2 0

2) 称取 24g 无水碳酸钠，用 850m1 水溶于大烧杯中，加 120g 含 4 分子结晶水的酒石酸钾钠，待全溶（可适当加热）后加入碳酸氢钠 16g, 再加入 120g 无水硫酸钠，全溶及冷却后加水至 900m1 ，沉淀 1~2 天，取上清液（要求严格时过滤）即可备用。使用前将 A 与 B 按 1 ： 9 混匀即可。

(2 ）砷钼酸试剂 :25g 钼酸铵［（ N H 4 ) 6 Mo 7 0 24 . 4H 2 0 ］溶于 450ml 蒸馏水中（加热溶解，但温度接近 150 ℃时易分解），待冷却后再加入 21 ml 浓 H 2 SO 4 混匀。另将 3g 砷酸氢二钠（ Na 2 HAs0 4 . 7H 2 0) 溶解于 25ml 蒸馏水中，然后加到钼酸铵溶液中，室温下放置于棕色瓶中可长期备用。

(3 ） 200ug/ml 葡萄糖标准液：准确称取分析纯葡萄糖 200mg, 溶解定容到 l000ml 。

3 .材料

新鲜植物组织。

四、操作步骤

1 .标准曲线的制作

在 7 支刻度试管中，分别加入 200ug ／ ml 标准葡萄糖 0 、 0.1 、 0 . 2 、 0 . 3 、 0 . 4,0 . 5 、 0 . 6 ml ，再顺序加入蒸馏水 2.0 、 1.9 、 1.8 、 1.7 、 1.6 、 1.5 、 1.4 ml ，配成每毫升含 0 、 10 、 30 、 40 、 50, 60ug 葡萄糖的溶液。每试管加入铜试剂 2m1, 混匀后沸水浴中加热 10min ，立即冷却，再加入 2m1 砷钼酸试剂，振荡两分钟后稀释到 15ml, 用分光光度计在 620 nm 波长下比色，测其吸光度。以糖含量（ ug ）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2 .植物样品还原糖的提取

将样品洗净，吸干其表面水分，切碎混匀，称取 1g 放入研钵中，加入石英砂约 0.5g, 磨成匀浆，将样品转移至 100m1 三角瓶中，加水约 70- 80m1, 摇匀置于 80 ℃恒温水浴上浸提半小时。

待样品冷却后，沉淀蛋白质：加入 5% 硫酸锌 5ml, 再慢慢滴入 0.3 mol/L Ba （ OH ） 2 5m1, 以沉淀蛋白质。振荡后静置，至上层出现清液后再加一滴 Ba(OH) 2 , 直至无白色沉淀时，溶液转移至 100m1 容量瓶并加水至刻度。

3 .还原糖含量的测定

过滤上述已定容的样品液，取 5ml 滤液，再定容到 100m1 （此步视样品的含糖量而定）。取已稀释的溶液 2ml ，与标准葡萄糖溶液显色法相同：加铜试剂 2ml ，煮沸 lomin ，加砷钼酸试剂 2m1 ，振荡 2min ，定容到 15ml ， 620nm 波长下比色，记录吸光度。

五、结果处理

六、注意事项

因材料不同，应适当调整稀释液倍数。

七、思考题

在提取样品时为何要沉淀蛋白质。