比色分析法和分光光度法测定蛋白质含量

【目的要求】

1. 掌握比色分析法和分光光度法基本原理、标准曲线的制作及使用，标准管法结果计算
2. 熟悉蛋白质含量测定常用方法、原理及应用
3. 了解常用可见光、紫外分光光度计 的测定原理及使用
【教学内容】
1. 酚试剂法蛋白质含量测定
Lambert-Beer定律，比色分析法和分光光度法基本原理, 722型分光光度计使用，常用蛋白质含量测定方法及应用，酚试剂法测定蛋白质含量原理、操作, 标准曲线的制备及使用
2. 双缩脲法蛋白质含量测定
自学和独立完成实验并与酚试剂法比较，结果计算
3. 紫外分光光度法蛋白质含量测定
紫外分光光度法测定蛋白质含量原理，方法，优缺点，注意事项；国产752型紫外分光光度计使用，UV—260分光光度计使用，注意事项，波长扫描，标准曲线制作
【实验原理】
一、比色分析法
许多物质本身具有一定的颜色，也有许多物质本身无颜色，在加入适当的显色剂后生成有色物质。溶液浓度越大，颜色越深。因此可以利用比较溶液颜色深浅的方法来测定有色溶液的浓度。这种方法叫比色分析法。


←光的互补示意图

1. 物质的颜色和波长：
可见光：波长（λ）400—760nm
紫外光：λ小于400nm
红外光：λ大于760nm


光的互补：将两种适当颜色的可见光按一定强度比例混合可得到白光，这两种光叫互补光，该现象叫光的互补。
单色光：白光通过棱镜后可分解成各种波长不同的色光，把具有一种波长，不能再分解的光叫单色光。
2. 溶液的颜色和光吸收的关系：
溶液的颜色，是由于不同的有色物质有选择地吸收某种颜色的光而引起的。溶液呈现的颜色是与它主要吸收的光相互补的光的颜色。溶液吸收的光越多，呈现的颜色越深。
例如：一束白光通过核黄素溶液，溶液呈黄色，是因为蓝色光被吸收，而其它颜色的光均为两两互补，透过光只多余出黄色光，所以核黄素溶液呈黄色。
光吸收曲线：测定同一物质对不同波长光线的吸收程度，以波长为横坐标，光密度为纵坐标作图，所得曲线为光吸收曲线。
3. 物质浓度，液层厚度与光吸收的关系（Lambert--Beer定律）：
当一束单色光通过溶液后，光被溶液吸收的程度（D）与溶液的浓度（C），液层的厚（L）以及入射光的强度（I0）有关。溶液浓度越大，液层越厚，吸光越多，这就是物质（均匀透明固体，液体，气体）对光的吸收定律。


lg I0 / I 意义：
当I = I0 时，lg I0 / I=0，表示溶液完全不吸收光线；
当I＜I0时，lg I0 / I值较大，表示溶液对光吸收较多；
当I→0 时，lg I0 / I值无穷大，表示光线几乎被溶液完全吸收（溶液不透光）。
由此可见，lg I0 / I表示了溶液对光的吸收程度。
表示方法： 光密度OD或D（opticaldensity）
吸光度A（Absorbance）
消光度E（Extinction）
于是，(3)式可写成：D = KCL
公式中K为消光系数，K = D/CL，表示有色溶液在单位浓度和单位厚度时的吸光度。
同一溶质，K值相同。
百分消光系数：C = 1%，L = 1cm
克分子 消光系数：C = 1克分子浓度，L=1cm
D=KCL意义：物质对光吸收程度与该物质的消光系数K，溶液浓度C，液层厚度L成正比。