pc12培养

丁香园myl0605的观点：

前几天为自己养的PC12是未分化还是分化型困扰,查了一些资料,现发上来希望能给有同样问题的战友有一点帮助!

培养条件:ＰＣ12细胞培养于铺有鼠尾胶原的玻璃培养瓶中,置于ＣＯ2培养箱(37℃,95%空气5%ＣＯ2),培养基选用ＤＭＥＭ(ｐＨ7.4,高糖),加入10%灭活小牛血清及5%灭活马血清。

分化前:ＰＣ12细胞在培养基中多呈圆形,直径15～20μｍ,也有椭圆或多角形的,扁平的细胞少见,倾向于聚集成小团簇状(A图)。

分化后:加入ＮＧＦ后的24ｈ内细胞停止分裂,长出似交感神经元样的突起;第4～14ｄ,细胞体积增大,突起增多并增长,形成网络,数周后,突起可长达500～1000μｍ(B图)。

NGF可促进PC12细胞向类似交感神经元样的形态分化,最终导致PC12细胞在生理、生化方面都具有神经元样的功能[12]。分化后的 PC12细胞对ACh的敏感性增大5~7倍

有的战友提到分化的PC12药敏性更好是不是因为分化后的 PC12细胞对ACh的敏感性增大5~7倍

未分化

分化

我是用1640养PC12的,细胞状态很好.因为分化后的PC12贴壁很好,等培养液颜色发黄,直接倒掉培养液,在加入就好了,但一般那个时候就可以传代了!

丁香园alg的观点：

我的也是PC12细胞，培养条件相同 牛，马血清各5%是唯一不同的

                   

                   

丁香园luop99的观点：

我的经验表明，只加FBS会出现PC12的分化，如alq图样，可能是FBS中含微量NGF,加马血清就不会出现分化，当然要10%浓度。也请教过协和老师，说是马血清可封闭牛血清刺激PC12分化的位点，究竟位点在哪？是否和NGF刺激位点一致，尚不清楚。不过按5%HS，10%FBS培养应该没错。

丁香园monde的观点：

我养这个细胞一年多了，有点经验和大家交流一下。

1.我用的是15％的马血清和2.5%的胎牛，胎牛要用进口的，国产的容易分化。

2.关于表面处理的问题，值得注意的是胶原和多聚赖氨酸使细胞贴壁的原理不太一样。多聚就是纯粹的物理黏附作用，而胶原则是刺激的细胞，使细胞的表达一些能有助于贴壁的蛋白，这种刺激作用还涉及到MAPK途径，所以如果做细胞信号转导的战友要注意到这点。相关的文献可以自己到pubmed上查找。

3.完全分化的细胞不能传代，因为贴壁已经很牢固，强迫其脱离可能造成，尤其是细胞的突起断裂，细胞存活率很低。

4.用NGF刺激的24－48h后，细胞可以消化下来传代或者冻存，用于继续培养。一般这种细胞叫做NGF activated cells。用于检测待测物的NGF样活性，指标是细胞突起的程度。

5.楼上有照片贴出来细胞呈现梭形，严格讲这种细胞已经不能叫做PC12了。严肃的话最好放弃。

6.该细胞容易聚集生长，传代种到新瓶子之前最好充分吹打，把细胞弄匀，否则传的细胞也呈现聚集的团，很难看。我的经验是消化液用EDTA加比较稀的胰酶，这样消化的细胞比较容易成单细胞悬液。

丁香园sir123的观点：

我目前已经养PC12一个多月了，经验谈不上很多，不过失败的教训倒是不少，可以拿出来和大家分享一下

1.细胞的培养基，我开始用10％FBS国产四季清的，DMEM，没加马血清和多聚赖氨酸什么的，因为条件关系，结果细胞贴壁性很好，生长速度还可以，3天1：2传代，在传到第5代时候，观察细胞状态下降，正常对照组也开始出现调亡，后查文献发现血清用多了，分析其内含有大量刺激生长物质，导致细胞出现分化，状态不稳定，目前改用5％FBS，DMEM，细胞生长速度明显放慢，现5天1：2传代，这和ATCC上PC12的倍增时间92小时比较接近。

2.传代时候的细胞密度，有人说传代时候细胞过密，可能导致细胞分化，但是我在细胞仅50～60％传代，细胞死亡率很高，因此目前改用80％传代，还算稳定，确实有分化的迹象，如，细胞出现多角形等，但属轻度，和楼主说的差不多，可能和我用国内血清有关。

3.胰酶对PC12无效。我个人提出胰酶消化PC12是个错误观点，其一针对悬浮PC12，胰酶消化的效果不好证实，其二，我养的PC12，性质贴壁，用100％胰酶消化1小时，愣是没动静，细胞甚至不变圆。最后用力拍打才可以，但代价是细胞损伤非常大，不好恢复。其三，ATCC上明确建议用细胞刮勺刮取PC12，目前我改用刮勺，细胞传代后状态要比用胰酶消化的好很多。

4.再者关于1640和DMEM的问题，我个人观点，二者的主要区别在于DMEM含糖量高，神经细胞都喜欢这，另外1640含一些离子，是防止培养的细胞贴壁。1640一开始主要应用于单克隆抗体的制备，其后因其比较适合国内特点，比如价廉物美啊，所以目前在很多细胞上都有应用，ATCC上建议用1640，更多的原因是防止贴壁，诱导分化。不过，2种培养基我都试过，好像在国产5％血清的条件下，1640培养基不能改变PC12性状。所以我采用DMEM，能量高啊。

5.因此我个人认为，5％的FBS，DMEM，足够PC12生长需要，4天左右1：2传代，可以不用贴壁处理（国产血清诱导轻度分化），如要求严格未分化，请参照ATCC推荐。

丁香园flyinskier的问题：

1.PC12复苏后是否第二天需要换液？复苏后多产时间才能贴壁和增殖？复苏后可以每隔24h观察还是不要去动它？多长时间可以观察？

2.正常培养期间，是否不能经常去动培养瓶，我指的是观察生长情况？最近的培养经常失败，是不是与我每天拿出观察有关？有一次因为显微镜灯泡坏调，2，3天没动，反而密密麻麻长了。

3.传代后多长时间可以贴壁，多长时间会到对数生长期？

4.传代最关键的是消化吧？我是这样做的，先用0.25的胰蛋白酶1ml轻微晃动一会儿，然后倒掉，再加0.5ml，封瓶，培养箱温育1min.镜下观察，同时肉眼观察，待有白色絮状物浮起。终止消化。您认为有否问题？

丁香园drcici的回答：

1.复苏后的换液时间取决于您复苏时是否洗涤离心细胞，去除了冻存液中的DMSO，如果没有去除DMSO，细胞培养过夜后就要彻底换液；如果复苏时洗涤离心过，可以待传代时再换液也可。（据我个人经验，还是复苏时去除DMSO，细胞的生长状态好一些）

2.状态良好的细胞复苏后 4 h即可贴壁，开始增殖，大约2 d即可传代。

3.每天观察一两次细胞我不认为会对细胞的生长造成不良影响，不过每次观察的时间不易过长。

4.传代时我认为最好不要用胰蛋白酶，因为胰蛋白酶对细胞有破坏作用。我以前用胰蛋白酶消化传代过PC12, 结果传代后的细胞虽然贴壁，形态也好，但就是增殖缓慢，所以我现在都是用枪吸取培养液直接吹打，传代后细胞增殖迅速，2 d就长满了（因为长的太快，我只好降低血清浓度，用5%FBS）

5.传代的时机最好选在细胞生长旺盛，占瓶底70%－80%时最好，如果细胞长的太满，细胞的状态会越来越差，最后大片死亡；这种细胞传代后生长也不好；而且长的太满后，细胞贴壁牢，难于吹起来，相反，70%－80%时细胞很容易吹起来。

6.如果细胞贴壁太紧，不得不用胰蛋白酶消化，注意低浓度，段时间，多洗涤。我一般用0.025％的胰蛋白酶，在镜下观察细胞突起收缩，有零星的细胞漂起就中止，或用肉眼观察，瓶底呈现薄雾状的模糊感时就中止，中止一定要彻底，要用含血清的培养液多洗涤离心几次，确保去除剩余的胰蛋白酶，否则传代后的细胞难以生长。

7.就培养器皿的选用，我推荐在60mm的培养皿中培养传代，第一，在皿里细胞生长的更快，我想可能是皿比瓶的气体交换更好吧；第二，传代时吹打更方便，不易污染。

丁香园flyinskier的问题：

用的FBS是国产的还是进口的，您认为国产的四季清可不可以用。您也不用HS吗？还有，洗涤离心除去胰蛋白酶是多少转多少分呢？几次？我的细胞传代后老是不长是否就是因为有胰蛋白酶没有终止干净呢？

我用PC12测试药物，用MTT的方法。96孔板，每孔100微升，100000个/ml的浓度。接种后24h给药，再过24h后是否就应该到了对数增长期了？

丁香园drcici的回答：

PC12是生存能力比较强的一种细胞株，用国产or进口的血清，加不加HS均可（这几种我都用过），不过HS更适于神经元的生长，FBS较利于增殖。另外据我所知，国产血清多为小牛血清or新生牛血清，并非真正的胎牛血清。不论使用那一种血清，提醒您注意一下是否已灭活。

去除胰蛋白酶时最好用含血清的培养液在4℃下离心，血清不仅可以中止胰蛋白酶的作用，对细胞也有保护作用，一般用800～1000rpm转10min即可，最好离心洗涤3次。传代后不长有可能与胰蛋白酶有关。

生长状态良好的PC12，接种48h应该到了对数增长期。

丁香园pz_penny的问题：

我的pc１２神经细胞繁殖速度超慢，已经超过一个月了，平皿的汇合度还只有大约３０％，我用的是f１２k培养基＋１０％ＦＢＳ．前次换液后，现在还出现了大量悬浮情况，细胞开始聚集成线悬浮于培养基中．按道理说几天就应该传代了啊，请问这是怎么回事呢．分化型和未分化型pc１２在生长速度上有差别吗？

丁香园luo_0712的回答：

PC12主要有未分化、低分化和高分化三种类型，三种类型的PC12在分裂速度上差异不大，关键在营养要求上。未分化与低分化的PC12一般用DMEM+5%FBS+10%HS；高分化PC12只要用DMEM+10%FBS就可以。你的pc１２细胞繁殖速度超慢，平皿的汇合度仅有３０％，可能是因为PC12贴壁能力低，你的平皿应该用鼠尾胶原或多聚赖氨酸进行coating。

丁香园pz_penny的问题：

加马血清是什么作用呢？是抑制分化吗？

我的细胞也是从别处拿到，不知道是不是已经分化后的，按理说应该是圆形，不过帖壁的细胞基本是多角形或者是呈突触状分布．如果是这样的细胞我是应该直接吹打，或者还是加胰酶消化呢？

丁香园wangpengljr的回答：

养细胞不要急，实验前要计划好，好好分析原因！你先按照大家的意见做做看，我看了看大家的意见，对你应该很有帮助！未分化的PC12是很难养的，要注意包被培养瓶。你的培养基最好换换，可以多查文献啊，一般是高糖的DMEM+5％FBS+10%马血清（我的经验是Gibco的马血清贴壁最好）；马血清的功能是抑制PC12细胞形态的变化，有利于贴壁生长，不会抑制你用NGF诱导的PC12分化的；胎牛血清的作用是与细胞的增殖有关。PC12换液不要太勤！3到4天换液都行，并且最好保留一部分（如三分之一）旧培养基，有利于细胞的贴壁与增殖！！你传代时用胰酶消化吗？？有人说用0.025％的胰酶消化30秒就足够了，你可以试试，我没有用胰酶也行，为了让细胞不起团，我用了0.02％的EDTA帮助吹散细胞，但是也有点麻烦就是要离心一次。总之，养好PC12的关键在于马血清的选择（Gibco的最好）以及传代过程中对细胞的处理（吹打太多会影响细胞的贴壁，反之PC12会成团).希望对大家有帮助哈，欢迎大家发表自己的意见！！讨论有益啊。

丁香园water_lam的回答：

你的细胞是刚复苏不久，它需要一段时间才正常的。我们开始的时候也是这样。但我们用的DMEM+马血清+牛血清，开始时也长得很慢，但过两个月后就开始长得很快，大概2～3天就要传代了。前一段时间因为我们的马血清都用完了，我们都没有给马血清，结果细胞还是长得很好，但是就有一些细胞出现低分化，所以马血清应该是有抑制分化的作用。

还有PC12是不怎么贴壁，我们做MTT时要让它们贴壁都是用多聚赖氨酸进行包被。多聚赖氨酸分子量300000，储存浓度1mg/ml(用PBS液配制)。4度保存。用时稀释到50微克/毫升，加到包被的容器里，37度孵育过夜（我们一般都晚上做的），早上回收多聚赖氨酸，照紫外4小时后，再铺板。这样细胞贴壁效果较好。多聚赖氨酸一般用3～4次，就不要了！这是我个人的做法，不妥之处请各位多多指教！

丁香园meihf37的问题：

我培养的是PC12细胞，不用胰酶消化，也可以吹打离壁，但是，现在，无论怎么吹打，都不能把细胞完全吹打散开，细胞成团，很难记数，请问各位同道中人，能不能提供有效的方法吹散细胞

丁香园Fang CY的观点：

pc12 细胞的贴壁性不强，但是为了获得单细胞悬液，还是建议你用低浓度的胰酶或不加EDTA的胰酶作用一下，这样就可得到单细胞悬液。如果一味的猛力吹打，细胞要受伤害而罢工的。

丁香园lujin的观点：

没这么容易变异的，一个细胞系之所以能建立，其稳定的传代也是原因之一。别人所做的跟自已做的无法绝对的来比较，你师姐培养的细胞密度与你的不一样，时间不一样，所用的培养瓶不一样，等等。

你可以试试60%或70%细胞密度时就传代，不用等到80%，看看是否能吹打下来。

在消化细胞时，我看到细胞都浮起来，赶紧终止反应，请问这正常吗，是否还要降低胰酶浓度？

这是不正常的，消化时间太过，可以减短时间 ，也可以降酶浓度，消化太过会对细胞产生损害。既然可以不用酶把细胞吹打下来，那么用了酶后，一定要尽快终止消化，否则就如你所说了。

丁香园scarret的问题：

我们从协和细胞所买了一株PC12细胞，现在养了大约一个月了细胞状态还不稳定，而且细胞状态每况愈下，不知道问题到底出在哪里？ 望各位经验之士给予指教。

我用的培养液1640+10%马血清+5%胎牛血清（国产），培养条件是完全给人家一样，除了胎牛血清（国产），是国产血清的缘故吗？

细胞买来时人家说是悬浮细胞，可我们原来养过这种细胞是贴壁细胞，悬浮就认为是死细胞！我查ATCC上说是poorly 贴壁细胞。而我养过大约1个月发现它们部分悬浮部分贴壁，所以我很迷惑PC12细胞到底是应该悬浮还是贴壁？如果悬浮了是不是细胞的性质也会发生改变了？

丁香园silentscope的观点：

1.ATCC上指明：PC12的culture conditions为RPMI1640+10%马血清＋5％胎牛血清，细胞形态为round or polygonal，在胶原酶coated的flask上为poorly adhered！一周passage twice！在nerve growth factor(50ng/mL)作用一周以后，停止分裂并且开始外生出processes，类似于sympathetic neurons，继续培养数周processes可以长达500~1000um。若去除NGF的作用，24h内processes degenerate，72h内resume multiply。passage 达70代其生物学性质也无明显改变！（来自Greene LA 1976,73:2424-2428)

2.不知flask用生长基质包被了没有，若无，PC12细胞既可呈悬浮生长又可呈贴壁生长！

3.国产的胎牛血清从质量上至多达到国外小牛血清的水平，本人建议楼主换用进口的FBS。本人应用PC12作转染试验，培养液为DMEM（high glucose)+15% calf serum(Hyclone)，细胞生长比较理想！

丁香园silentscope的观点：

1.多聚赖氨酸一般用PBS或BSS配置成10倍质量的工作储存溶液（0.5mg/mL），使用时再稀释成工作浓度（0.05mg/mL），包被flask的过程如下：

1）将工作浓度的多聚赖氨酸溶液加入到培养容器内，一般要求覆盖或湿润培养器皿的生长面即可，若要包被盖玻片，可将盖玻片直接置入盛有多聚赖氨酸工作液的容器内；

2）包被时间为37℃静置2～4h或室温过夜（倾向于包被时间长些）；

3）倾去多聚赖氨酸，消毒三纯水洗涤培养器皿数次；

4）接种细胞前，培养液洗涤培养皿一次。

2.我用DMEM（high glucose)原因是转染试验中细胞采用此培养液效率高些。

3.现在有的reseacher应用的PC12在不加NGF的情况下也可外生出突起并且可以分裂，严格意义上说这种细胞已经不再是PC12了。

丁香园Ginkgokeer的问题：

PC12细胞如何进行培养？该细胞为贴壁生长还是悬浮生长？如何换液？是否需要传代？

丁香园jackie2005jl的观点：

我养的也是PC12，不过是两天传代一次，，这个属于贴壁不太牢的细胞，可以直接吹打，我没有用离心处理，也未用多聚赖氨酸处理，长得很好，比较好养

丁香园pang1983223的观点：

1.复苏后第二天要换新的培养基，不然DMSo会在几代以后使细胞分化

2.培养基中一定要加HS，10%，ATCC为15% ，马血清有封闭PC12细胞分化位点的作用！

3.冻存的时候应该按照ATCc的配方，即15%ＨＳ，２．５％ＦＢＳ，得高糖ＤＭＥＭ，加５％的ＤＭＳＯ来冻存，否则传数代后易分化！