球体培养

用胰蛋白酶消化单层细胞或分散原有组织，将细胞接种到涂布琼脂的底物上。将聚集物转移到 24 孔培养板，进行分析。

诺贝尔琼脂 0.25%胰蛋白
生长培养液 超纯水
培养瓶 24孔培养板 Petri培养皿

一、用球脂涂布 25 cm² 培养瓶

1. 将 1 g 诺贝尔琼脂加入 100 ml 带有松螺旋盖的硼硅酸盐玻璃瓶中，瓶内装有 20 ml UPW。

2. 在 100℃水浴中将琼脂加热 10 min，或直至琼脂完全溶解。

3. 立即将瓶中的内容物加入预热至 37℃ 的 60 ml 生长培养液中，然后分别按 5 ml 量加入每个培养瓶中。保证琼脂内无气泡。

4. 将琼脂在室温条件放置约 5 min，以准备 1.25% 琼脂包被的培养瓶。

二、用琼脂涂布多孔培养板

1. 将 0.5 g 琼脂加入到 10 ml UPW 中，如涂布 25 cm² 培养瓶的步骤 2 加热，然后加入 40 ml UPW。

2. 在 24 孔板的每个孔内加入 0.5 ml 终溶液，准备 1% 琼脂涂布的培养孔。精确和小心地加入是很重要的，以保证在随后球体的观察中很容易对各个孔进行显微镜聚焦。

三、球体形成

1. 对于已建立的细胞系，用胰蛋白酶消化汇合的单层细胞，或者使间体肿瘤细胞分散，以产生单细胞悬液。

2. 如果需要，可用含血清的培养液中和胰蛋白酶。

3. 用电子细胞计数器或血细胞计数板对细胞进行计数。

4. 在每个琼脂预涂的 25 cm² 培养瓶中加入 5 ml 含 5x10⁵ 个细胞的生长培养液，然后培养细胞。如果细胞具有球体形成的能力，3~5 d 内可自发形成聚集的小簇（直径约为 100~300 um）。

为了便于以后的生长，应当将球体移入新的 25 cm² 培养瓶或 24 孔培养板。

四、转移到 25 cm² 培养瓶

1. 将原培养瓶中的培养物移入锥形离心管或普通容器中。

2. 让球体沉降后，取出上清和单个的细胞。

3. 用新鲜培养液将球体再悬浮，然后将悬液移入新的琼脂预涂的培养瓶。球体可在这些培养瓶中通过外层细胞的分裂继续生长。

五、转移到 24 孔培养板

1. 将每个 25 cm² 培养瓶中的培养物移入 6 cm Petri 培养皿。

2. 在 24 孔板的每个琼脂预涂的孔中，加入 0.5 ml 培养液。

3. 在低倍镜（40x）下，逐个地选择一定大小的球体。用 Pasteur 吸管和 Pipump 或借助具有适当微调的其他移液器，将选定的类似直径的球体逐个移入琼脂预涂的 24 孔培养板的每个孔中。

4. 将 24 孔培养板放入 CO₂ 培养箱。

5. 每周更换培养液 1 或 2 次，每次换液 0.5 ml。或每周 1 或 2 次加入培养液 0.5 ml (没有移出任何培养液），2~4 周后培养液达到 2 ml/孔。

涂布琼脂时，所有的培养瓶、培养板和培养皿都应是无菌的，但不需要达到组织培养级。