干货：循环肿瘤细胞（CTC）的检测策略

CTC定义

循环肿瘤细胞是指从肿瘤上脱落并进入循环系统的癌细胞，在那里它们可以通过简单的血液检测来发现。这些细胞可作为癌症的生物标志物，指示远端是否存在肿瘤，以及它们的遗传状况和药物敏感性。与手术干预不同，CTC与纵向研究兼容，能够有效指导治疗。然而，要理解它们的意义，也没那么简单。

CTC，与肿瘤本身一样，是高度异质性的，加州大学旧金山分校的解剖学教授Zena Werb如是说。一些CTC有能力产生新的肿瘤，而另一些则没有。一些表现出癌症干细胞的特性，而另一些则不是。目前，美国FDA批准的唯一一种CTC临床检测是杨森诊断公司（Janssen Diagnostics）的CellSearch，它能有效定义上皮来源的CTC，即EpCAM、DAPI和细胞角蛋白阳性，而CD45阴性。

当然，并非所有肿瘤都来源于上皮细胞，甚至上皮肿瘤也可能逐渐丧失上皮标志物（CellSearch被批准用于转移性乳腺癌、结肠直肠癌和前列腺癌）。而且有迹象表明，除了癌症，炎症也可能导致血液中存在上皮细胞。Werb认为，这个故事比我们想象的要复杂得多。

据杨森诊断公司的研发部门主管Ron Mazumder介绍，血液中存在可检测CTC的患者比例随癌症类型的不同而不同。比如，结肠直肠癌、卵巢和乳腺癌大约是50-70%，而非小细胞肺癌则低至30%。这些患者体内的CTC数量也相差甚远，从单个细胞到几千个。“中位数大约是二、三十个细胞，”Mazumder谈道，但他们发现，转移性乳腺癌和前列腺癌患者中每7.5 ml血液中有五个CTC或以上的，预后情况要比CTC较少的患者糟糕得多。因此，五个被设为临界值 – 如果CTC的数量更多或更少，这对患者生存有着显著的影响，而且在多个癌症类型中都是如此。

微流体选择

原先，CellSearch完全依靠细胞计数。如今，用户也能获得这些细胞的遗传信息。2014年8月，杨森宣布与Asuragen建立伙伴关系，对分离出的CTC开展新一代测序，以鉴定几百个癌症相关基因中的突变。

CellSearch是基于阳性选择，利用抗体包被的磁珠来捕获EpCAM阳性的细胞，然后成像并计数。因此，麻省总医院癌症研究中心的助理教授Shannon Stott认为，你需要预先知道你要寻找的细胞的特性。然而，并非所有CTC都有着相同的物理和生物学性质。

Stott有着机械工程的背景，与几位同事合作，她开发出分离CTC的新方法。2010年，她开发出一种“人字形CTC芯片”，利用EpCAM抗体来捕获CTC [1]。她表示，这种设计能够比较快速地处理血液（每小时2 ml），且具有良好的灵敏度和选择性。不过，它无法解释不同的抗原谱。而捕获的细胞粘在芯片表面，使得后续培养成为问题。

2013年，麻省总医院的团队开发出第三代的技术，称为CTC¬iChip [2]。这个iChip中的i代表惯性聚焦（inertial focusing），即通过流体作用力将细胞排成一列纵队。芯片利用流体力学分选，去除最小的血液成分。然后， 它利用正向选择来去除淋巴细胞，保留剩下的一切。

据Stott介绍，iChip比人字形芯片要快得多，每小时能处理20 ml血液。它还能产生未标记的细胞，便于培养和 分析。她的同事Daniel Haber的团队从六位乳腺癌患者中建立了CTC细胞系 [3]。对这些细胞系的测序鉴定出 新获得的突变和药物敏感性，这些信息能帮助开发更好的治疗策略。在另一项研究中，Haber的团队对分离出 的CTC开展单细胞RNA¬seq，并将它们与同一位患者的CTC聚集体进行比较，以了解这些成簇CTC结构的性质 [4]。与单独的CTC相比，成簇的CTC有着更大的转移潜力。分析鉴定出一个细胞连接相关基因，称为 plakoglobin。

目前，杨森诊断公司正与麻省总医院的团队合作，希望将iChip转化成新一代的CTC分析平台。

CTC成像

《Nature Reviews Clinical Oncology》上的一篇文章回顾了CTC分析和鉴定的原理 [5]。文章中有一个表格， 列出了精选的检测技术，其中大部分是基于CTC的抗原谱或物理性质。表格中提到的一种替代策略是图像流式 细胞仪，这种方法由默克密理博商业化。

ImageStream和FlowSight都是图像流式细胞仪，本质上就是带有照相机的流式细胞仪。随着每个细胞通过， 它在明场和暗场模式以及多达10个荧光通道下成像，产生每个细胞的12幅图像，且每秒能成像2,000个细胞。 这两个平台之间的差异是ImageStream能放大到60倍，而FlowSight提供固定的20倍放大。

尽管所得到的细胞无法培养，但是当细胞通过系统时，用户也能开展各种分析。例如，他们可以对细胞外和细 胞内标记进行染色，以确定细胞的来源，或者用RNA¬FISH探针染色，对转录本进行计数。

当然，传统的流式细胞仪也能获得许多参数，而图像流式细胞仪能为你带来自信，这少少的阳性细胞正是 CTC。“眼见为实，”默克密理博细胞分析的高级总监David Basiji说道。如今，这家公司正在努力实现CTC的分 离，便于下游研究的开展。

参考文献

[1] Stott, SL, et al., “Isolation of circulating tumor cells using a microvortex¬generating herringbone¬chip,” Proc Natl Acad Sci USA, 107:18392–7, 2010. [PubMed: 20930119]

[2] Ozkumur, E, et al., “Inertial focusing for tumor antigen¬dependent and –independent sorting of rare circulating tumor cells,” Sci Transl Med, 5:179ra47, 2013. [PubMed: 23552373]

[3] Yu, M, et al., “Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility,” Science, 345:216–220, 2014. [PubMed: 25013076]

[4] Aceto, N, et al., “Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis,” Cell, 158:1110–22, 2014. [PubMed: 25171411]

[5] Krebs, MG, et al., “Molecular analysis of circulating tumour cells—biology and biomarkers,” Nat Rev Clin Oncol, 11:129–44, 2014. [PubMed: 24445517]