病毒空斑实验问答

问：我准备做病毒空斑实验，不知到怎样配置甲基纤维素覆盖培养液，敬请各位指教

答：1、我是这么做的：

24孔板VERO，HSV1
1）24孔板预板
2）24h后，弃培养液，用hanks液洗1次
3）接种病毒液0.1ml/孔
4）放入37度5％CO2培养箱1h，期间每15min慢摇一次，使病毒充分吸附
5）加入1％甲基纤维素（1ml/）孔覆盖培养基，放入37度5％CO2培养箱继续培养
6）3天后，吸弃培养基
7）加入5％甲醛1ml/孔固定4min，弃甲醛，加入结晶紫0.8ml/孔染色20min
8）自来水缓缓冲洗染液，计算孔斑数

2、我的老师做空斑试验也是用甲基纤维素，不过浓度是2%，配置方法是：甲基纤维素：3克溶于150ml蒸馏水中，最终浓度为2%；染色用的碘液：25g溶于500ml95%的乙醇中。最终浓度为5%做出的效果很好。不过甲基纤维素要提前很长时间配置，大约2周，高压后放入冰箱，使用前无菌操作加入培养液，混匀放入冰箱，过一天后再拿出，使劲摇匀，使纤维素达到一种匀质的状态，静置至起泡完全消失后使用。 染色可以用中性红0.1%（w/v)温箱孵育2-3小时，若是6孔板每孔加1ml;倾倒后即可计数。

问：“1％甲基纤维素（1ml/）孔覆盖培养基，放入37度5％CO2培养箱继续培养”是指把1％甲基纤维素直接加入已放好培养基的孔里，还是甲基纤维素和培养基混好再加入细胞中？配方比例是什么？甲基纤维素要提前很长时间配置，大约2周为什么？什么时候可以计数了？以什么为标准呢？

答：1、1％甲基纤维素（1ml/）孔覆盖培养基应是指按1ml/孔的量加甲基纤维素覆盖培养基。甲基纤维素覆盖培养基应该就是指Viscous medium,它是一种专门培养基。简单的说就是在普通细胞培养液里面添加了甲基纤维素来提供粘性,甲基纤维素应非营养物质。因甲基纤维素难溶，所以要先配并灭菌好甲基纤维素溶液。然后在无菌条件下往其中补加其他培养基所需成分，注意MEM 配的是10×的，这样要加的MEM 溶液体积就少的多。我按protol配好Viscous medium其最后总体积约 400 ml，所以10× MEM只需40 ml。其他成分所加量按配400 ml 培养基换算就是了。所以甲基纤维素和培养基不是分开的，甲基纤维素只是这种培养基里的一种成分而已。

至于什么时候可以计数要看感染后CPE出现情况，这个要看具体测的病毒，刚开始每天坚持观察并计数就是了，直到没新的斑出现，大概都应在一周内吧。这个做一遍就可摸索出来。

2、我也用Viscous medium做病毒空斑实验，甲基纤维素覆盖培养液具体配方如下，供参考：In a glass bottle, combine 8.8 g methyl cellulose (4000 centipoise ,Sigma) with 320 ml distilled water. Stir with a large magnetic stirrer. Autoclave 30 min at 121 ℃, leaving the magnetic stirrer inside the bottle. Remove from autoclave while still hot and stir again until methyl cellulose has completely dissolved (usually a few hours).Add 40 ml 10× MEM or 10× DMEM, 40 ml FBS, 40,000 U penicillin, 40 mg streptomycin, and 4 ml of 1 M HEPES. Add L-glutamine and sodium bicarbonate according to the medium supplier's recommendations. Store up to 6 months at -20℃.配置此 Viscous medium 确实挺麻烦，所用试剂多， 甲基纤维素是难溶解，不过我按上述方法大概两三天内也溶好了。只要配好了甲基纤维素溶液，其他步骤都简单了。

问：还想请教，不管用什么培养基，怎么灭菌？用高压的话 琼脂拿出来后很快就凝固了呀 要是高温就加进去 细胞会被烫死的，那个琼脂稍微加热溶解一下都很快凝固的，请指教。

答：可用低熔点琼脂糖呀，压完后放在42度保温培养基37度保温，用时混合半小时内不会凝的。我做的空斑实验就是用的低熔点琼脂糖，效果很好。当然也是文献推荐的因为我是做杆状病毒-昆虫表达系统的，上层覆盖物只是防止病毒随液体扩散。