虫媒病毒的病毒分离与鉴定

病毒分离是判定虫媒病毒感染的金标准，但是否能分离到虫媒病毒与标本采集的时间密切相关。

定虫媒病毒感染的基本原理是发病后 5 天以内采集的标本的病毒分离率远远高于 5 天以后采集的标本。尽管病毒分离是确诊病原最可靠的方法，但因至少需要 1 周时间才能出结果，相对费时、烦琐，因此不适宜作为虫媒病毒感染的早期诊断方法。

器材：乳鼠、鸡胚

1. 乳鼠分离

乳鼠脑内或脑腹内联合接种分离是古老的登革病毒分离方法，分离过程中需多次传代才能使乳鼠发病。该法实验成本高，耗时长，分离阳性率低、需特殊的生物安全设备，现已极少使用。

2. 蚊虫分离

蚊幼虫脑内接种或成蚊胸腔接种是最敏感的登革病毒分离方法，敏感的蚊种主要有埃及伊蚊、白纹伊蚊、华丽伊蚊等，一般接种后 4~5 天即可分离到登革病毒。用蚊虫作病毒分离，即使血清中含有一定效价的抗体，也能分离出病毒，雄蚊和雌蚊均具有较高的敏感性。

3. 鸡胚分离

蝉传脑炎病毒在鸡胚中发育良好，一般可选择 7 日龄前后的鸡胚分离病毒。

4. 细胞分离

① 登革病毒等蚊媒病毒：细胞分离包括哺乳动物细胞分离和蚊虫细胞分离。哺乳动物细胞主要有恒河猴细胞（LLC-MK2）、非洲绿猴肾细胞（Vero）和金黄地鼠肾细胞（BHK21），其中以 LLC-MK2 细胞较为敏感；蚊虫细胞主要有白纹伊蚊细胞（C6/36）。伪盾纹伊蚊细胞（AP61）和安汉巨蚊细胞（TRA-284），其中以 TRA-284 细胞较为敏感，但以白纹伊蚊传代细胞 C6/36 细胞最常用。与其他方法相比，细胞分离比乳鼠分离有更高的分离率，操作更简便、成本更低，虽然分离的敏感性不如蚁虫分离，但细胞的维持相对容易，细胞病变易于观察、可产生大量的病毒等，因此，细胞分离法特别是蚊源的 C6/36 细胞在目前虫媒病毒的分离上应用最广泛。

② 螂传脑炎病毒：鸡胚成纤维细胞和猪肾细胞接种病毒能产生病变及空斑，且比小白鼠脑内接种更敏感。羊肾细胞与小白鼠的敏感性大体相同，也可用于分离病毒。